JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em> E. coli</em

Published: July 30, 2014
doi:
10.3791/51464
, , ,
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB),Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d’Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO),Commissariat à l’énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

Summary

Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır.

Abstract

Escherichia coli (E. coli), yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için rekombinant proteinlerin üretimi için en yaygın olarak kullanılan sentezleme sistemidir. Birçok protein çözünmeyen bir biçimde ifade edilmiştir Bununla birlikte, bazen proteinlerin saflaştırılması zordur. Zor veya çoklu hedefleri ile çalışırken bu nedenle hızla çözünür ifade için şartları tanımlamak üzere yüksek verim (SDP), küçük bir ölçekte protein ekspresyon tarama (1-4 ml kültür) kullanılması tavsiye edilir. Laboratuar çeşitli yapısal genomik programları, (rekombinant proteinin 0.1-100 mg / L kültür aralığında) nicel ve HTP protein ifadesi tarama protokolü proteinlerin binlerce uygulanan ve geçerliliği ile başa çıkmak için. Protokoller bir sıvı taşıma robot kullanımı ile otomatik ama aynı zamanda özel ekipman olmadan manuel olarak yapılabilir.

Disülfit zengin zehir proteinler kazanıyorterapötik ilaç potansiyel olarak onların potansiyeli için bilinirliğinin artması. Bunlar son derece güçlü ve seçici olabilir, ancak bunların karmaşık disülfid bağı ağların üretilmesi için, zor hale. 7.ÇP, Avrupa Venomics projesi (bir üyesi olarak www.venomics.eu ), bizim meydan fonksiyonel karakterizasyonu için yeni venom proteinlerinin binlerce üretmek amacı ile başarılı üretim stratejileri geliştirmektir. Disülfid bağı izomeraz DsbC redoks özellikleri yardımıyla, biz E okside, fonksiyonel zehir peptitlerin sentezlenmesi için HTP üretim boru hattı uyarlanmış coli sitoplazma. Protokolleri de çeşitli disülfid açısından zengin proteinlerin üretimi için de geçerlidir. Burada bizim boru hayvansal zehir proteinlerin üretiminde uygulanan göstermektedir. Protokolleri ile, burada tarif edilen bu çözünür disülfid zengin proteinler bir hafta gibi kısa bir sürede elde edilebilir olasıdır. Hatta küçük ölçekli, inci kullanmak için potansiyel vare pilot çalışmalarda, veya hassas mikro deneyleri için karakterizasyon için, kütle spektrometresi ile oksidasyon durumunu doğrulamak için proteinler saflaştırılmıştır.

Introduction

Genomik ilerlemesi ve yeni proteinlerin keşif hızlandırılmış oranda motive olmuş, yüksek verim boru hatları tarama ve optimal protein üretim stratejilerinin belirlenmesi için geleneksel yaklaşımlar parallelize için geliştirilmiştir. Optimize edilmesi olası değişkenler farklı sentezleme hedef şaperonlar 14,15, 5, füzyon ortakları 6-13, ko-ifade varyantları, 1,2, 3,4 sıcaklık, ortam 2,3 suşları, sitoplazmik arasında, ancak bunlarla sınırlı değildir: ya da periplazmik ifade 16-18 ve arıtma tampon bileşenler 3. Batch-parti varyasyon sınırlandırarak, yüksek verimlilik yaklaşımlar, çok değişken ya da pek çok hedef verimliliği yüksek düzeyde paralel olarak test edilebilir uygulayarak. Bizim tecrübelerimize göre, strateji de aynı kültürü (sıcaklık, medya, havalandırma, vb) ve arıtma koşulları (aynı resi kullanarak ölçek-up üzerine iyi tekrarlanabilirlik verirn, tamponlar, vb.) Çeşitli yüksek verimli platformları, yani bu tip füzyon ortakları, ekspresyon suşları veya sıcaklık 19-23 gibi değişik parametreler aracılığıyla, çözünür protein ifadesi için koşulları belirlemek için son on yıl içinde kullanılmıştır.

Yakın zamanda çözünür disülfid açısından zengin proteinlerin 11 ekspresyonu için yüksek verimli tarama yaklaşımı kullanılabilir. Seçilen Proteinler zehirli kaynaklarından sadece, ama aynı zamanda bitkilerin, domuz, inek ve insan da dahil olmak üzere türlerinin geniş bir disülfid zengin enzim inhibitörleri dahildir. Deney, 12 farklı füzyon ortakları ve 28 disülfür ağsı proteinlerin çözünürlüğüne ve katlama üç farklı ekspresyon suşları etkilerini karşılaştırdık. Bu soy BL21 içinde üretimi için bir füzyon partneri (DE3) pLysS olarak DsbC kullanılarak çok outproduced (elde edilen çözünebilir proteinlerin verimi ve sayısı hem de) gerilme ve kaynaşma bunların herhangi bir kombinasyonu test edilen 11 olduğunu gösterdi.Bu deneyin sonuçları disülfid zengin hedeflerin ekspresyonu için daha uygun bir içine (proteinlerin geniş bir ekspresyon taramasında kullanılmıştır) orijinal genel yüksek verimlilik boru hattı 22,24 uyarlanması için temel oluşturmuştur. Hayvan zehirlerinden disülfit zengin proteinleri özel ilgi konusudur. Zehirleri farmakolojik ve terapötik potansiyel değeri ile, biyolojik olarak aktif peptidler ve proteinlerin bir karmaşık bir karışımıdır. Bununla birlikte, disülfid bağı ihtiva eden proteinlerin ifadesi önemsiz değildir. Bu proteinler genellikle yedi disülfid bağları göre bir içerirler, ve aktif olmak için doğru disülfid bağlayıcı desenleri ile okside edilmesi gerekir. Şu anda, platform 7. Çerçeve Avrupa VENOMICS Projesi (www.venomics.eu) bir parçası olarak disülfit zengin zehir hayvansal proteinlerin büyük sayıda ekspresyonunu tarama ve hedefler binlerce yüksek kapasiteli ekspresyon için yeni protokolleri kıyaslama için kullanılıyor . Burada, otomatik bir yöntemyüksek verimlilik küçük ölçekli ekspresyon tarama ve arıtma için (bkz. Şekil 1) için sağlanmıştır disülfid zengin hayvan zehir proteinleri uygulanabilir. Disülfid zengin peptitler ve proteinler için bir strateji, hedef proteinlere HIS-bölünebilir DsbC füzyonları oluşturmak saflaştırma ve redoks-aktif füzyon partneri, DsbC için bir HIS-etiketi, (bkz. Şekil 2) kullanır.

Protokollerin odağı burada bir sıvı taşıma robot ve HTP elektroforezi kullanılarak otomasyon iken, bu yöntemler bir temel kurulum bile laboratuvarlar pahalı ekipman için herhangi bir önkoşul olmadan protokollerin yararlanabilirsiniz yani, aynı zamanda yüksek verim manuel yaklaşım için uygundur . Arıtılmadan ve analiz (disülfid zengin proteinlere özgü olmayan) için transformasyon için başka protokoller Manual 24 yayınlanmıştır ve burada tekrar edilmeyecektir. Rekombinant ile üretilen sentezleme klonundan manuel prosedürün hacmi (çözünür protein seviyelerinin analizi ulusal klonlama 25) SDS-PAGE algılama) veya 384 (4 x 96 kullanılarak (96 olduğu, (bkz. Şekil 1)), haftada kültürleri nokta leke ve SDS-PAGE 26 kullanılmıştır. (Örneğin, bir kaliper GXII LabChip sistemi 22 ile olduğu gibi, bir sıvı kotarma robotu ve nokta leke veya 26 HTP elektroforez kullanılarak bir yarı-otomatik bir şekilde gerçekleştirilir, bu arttırılabilir burada tarif edildiği gibi bir hafta boyunca paralel olarak en fazla 1,152 (12 x 96) kültürleri, sonuçlar) analizi için. Düzenli sallayarak inkübatör yeterli havalandırma için kısa yörünge yüksek hızda sallayarak kuluçka kullanımını gerektiren 96 (DW96) formatında, (sallayarak derin kuyu içinde yetiştirilen kültürler aksine kullanılabilir böylece kültürleme derin kuyuda 24 (DW24) biçiminde yapılır 800 rpm). Otomatik indüksiyon ortamı 27'nin kullanımı da manuel indüksiyon aşamasını ortadan kaldırarak, ifade kolaylaştırır. Laboratuarlar zaten önceden tanımlanmış ifade ve Puri kullanmak hatta neredebahsedilmekte koşulları, bu sadece verimliliği artırmak için bu HTP sisteme doğrudan transfer edilebilir. Disülfid zengin proteinleri için yüksek verimli tarama hattı ayrıntılı bir şematik Şekil 3 'de verilmiştir. Boru hattı parametreleri ile proteinlerin üretimi için en faydalı koşullarını seçmek için izin kapsamlı tarama deneylerinde, 11, 22 göre seçildi.

Karakterizasyon numunenin mikrogram onlarca yeterli, veya hassas fonksiyonel deneyleri ve bağlama deneylerinde (örneğin, düşük hacimli HTP patch clamp sistemleri 28) için kılavuz çalışmalarında küçük ölçekli ifadeleri tarafından doğrudan saflaştırılmıştır etiketli proteinler üzerinde gerçekleştirilebilir. Aynı hatta etiketi ve proteaz (ters faz HPLC ile, örneğin) kaldırılır mesafede, yarılmadan sonra etiketsiz hedeflere gerçekleştirilebilir. Kalite kontrolü de (beklenen boyutu ve oksidasyon st teyit etmek için kütle spektrometresi ile yapılabilirate) veya kromatografik yöntemler () 29 saflığını veya heterojenliği onaylayın. Bazen bölünme (özellikle zayıf çözünür proteinler 30,31 için) gereksiz ve hatta istenmeyen bir etiket, bu nedenle bu protokol bölünmesinde isteğe bağlıdır. Ne olursa olsun, tüm yapılar, doğrudan (Şekil 2 ve Tartışma) bölünmesinden sonra yerli protein üretmek için, hedef genin bir önceki TEV proteaz bölünme sitesi (ENLYFQ / [G] 32) vardır. , Füzyon etiketinin yarılması isteniyorsa, bölünme etkinliğini analiz etmek için, küçük ölçekli (elüsyon fraksiyonu üzerinde ya da 'sütunu') test edilebilir, daha sonra ölçek büyütme deneyleri için verim güvenilir bir tahminini elde etmek ve eğer gerekli koşulları optimize eder.

Afinite saflaştırma sırasında kullanılan tanelerin hacim için iki seçenek Deneyin amaçları ve beklentilere bağlı olarak bulunmaktadır. (Pilot deneyleri ya da MS saflaştırmak için ya da extrapol için mümkün olduğu kadar çok protein yakalamak edebilmek) ölçek büyütme elde etmek yedi reçinenin 200 ul nihai hacim sistemin doyurulmasından önce 1-100 mg / L kültür aralığında çözünür proteinin saptanmasını sağlayan kullanılmalıdır) Bölüm 8.1 'de (protokolü (A bakınız) . Deneyin amacı, çözünebilir proteinlerin düşük miktarlarının tespiti ise, ancak, o zaman reçinenin 50 ul'lik bir nihai hacim (B (protokolüne 0.1-25 mg / L kültür aralığında çözünür proteinin saptanmasına olanak tanıyan, uygun bir ) Bölüm 8.2).

Gerekirse Üretim çözünebilir ifadesi için tanımlanan koşullar kullanılarak daha fazla yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için saflaştınldı hedefler miligram miktarları elde etmek için, yukarı ölçeklendirilebilir. AFMB kullanılan ölçek-up protokollerinin ayrıntıları başka bir yerde 22,24 tartışılmıştır.

Deney düzeneği, protokol dahilinde kritik adımlar ile ilgili diğer detayları, modifikasyonlar ve sorun giderme ve teknik sınırlamalar diskin sağlanırussion. Deneyler başlamadan önce tartışma okuyunuz.

Her aşamada% 90 başarı oranı beklemek protokolleri boyunca (örneğin, kültürlerin en az% 90, herhangi bir aşamada büyümesi olmalıdır). Deneyde bir aşamasının başarı oranı% 90 altına düşerse numuneler atılır ve deney yapıların tam toplanması için tekrarlanır. Bu, test edilen protein son derece bağımlı olacaktır Ancak, bu başarı oranı, çözülebilir proteinler veya% 100 verimle bölen konstruktların oranını ifade yapıların sayısı için geçerli değildir.

Robot tezgahının set-up için özel ayrıntıları alternatif Worktable set-up için gerekli olan ancak onlar adapte edilebilir, (ayrıca bakınız Şekil 4) her protokol için sağlanmıştır. Robot donanım (Tecan) 96-kanallı koluna (MCA96), robotik manipülatör (RoMa) ve 8-kanal, sıvı taşıma başının (oluşurLIHA). MCA96 kullanan tüm adımlar da LIHA adımları arasında yıkanacak gerekir, çünkü ancak daha uzun sürer, bir MCA96 mevcut değilse LIHA kullanılarak yapılabilir. Robot teknik olarak steril bir ortam olmasa da, antibiyotik dahil genel olarak kirlenme ya da kısırlık ile ilgili sorunlar yok olmasını sağlar.

Protocol

Kısım A: Dönüşüm ve Test Anlatım Klonlama 22 ve arıtma için dönüşüm için manuel işlemler başka 24 tartışılmıştır. Transformasyon protokol tam olarak robot 26 üzerinde gerçekleştirilebilir fakat genellikle daha fazla zaman tasarrufu elle yapmaktır. Bu nedenle protokolleri burada karıştırır elle yapılan ısı şok dönüşümü ifade eden ön kültür ve dönüşüm kaplama aşılamadan itibaren başlar. Manuel klonlama ve dönüşüm prosedürleri hakkında daha ayrıntılı bilgi için ilgili referanslar 22,24 bkz. 1.. Ön kültür ve Kaplama : Robot tezgahı (konumları için bakınız Şekil 4) hazırlayın 150 ml steril LB et suyu ihtiva eden 300 ml'lik bir oluk koyun (ampisilin (100 ug / ml) ile takviye edilmiş / Kloramfenikol (34 ug / ml), ya da başka uygun antibiyotik), 8 pozisyonundaki. Steril DW koyun11 pozisyonunda 96. Pozisyonlara 14-17 in üzerindeki kapak ile 4x önceden hazırlanmış 24 oyuklu LB agar (Amp / Cam) doku kültürü plakaları (her bir çukura 2 ml agar içeren) koyun. 13 de (96 dönüşüm, ısı şoku sonra karışımları içeren) dönüşüm plakası koyun. Bu sıvı ön kültür ve LB agar plakalarının aşılanması için kullanılacaktır. 18'de steril 200 ul pipet uçları bir kutu koyun. Her 1 ml LB suyu bir nihai hacim içinde de var olduğu kadar, 96-kanallı kol (MCA96) ve 200 ul ipuçları, aspire LB suyu (8 konumu) arasında 200 ul kullanılarak, ve 11 pozisyonunda da DW96 içine tevzi. Tekrar DW96. Bu sıvı ön-kültür olacaktır. Robotik manipülatörü (RoMa) kullanarak, ilk 24-çukurlu LB agar plaka kapağı çıkarın ve kaplama bu levha tamamlanana kadar (bir otel, bir taşıyıcı içinde örneğin) başka yerleştirin. (LIHA) kafa işleme 8-kanallı bir sıvı kullanılarak, t sonra aspire 50 ul karıştırın13 konumundaki dönüşüm karması o ilk sütun. dönüşüm karması Bu hacim iyi LB-Agar karşılamak için yeterli değildir. (Şekil 5'de gösterildiği gibi), birinci kanal ile 4, 14 de ilk 24 oyuklu LB agar levhasının ilk kolona dağıtmak. Son 4 kanal ile, ilk 24-çukurlu LB agar levhasının ikinci sütun üzerine dağıtmak. Iyice dağıtma sonra tüm ipuçlarını yıkayın. 24-iyi Şekil 5 'de verilen şema kullanılarak göre – tüm dönüşümler 96 gelen aktarma, 14 de birinci plaka üzerine kaplama kadar bu işleme devam edin. Birinci plaka tamamlandıktan sonra, kapağı yerine takın ve 15 konumunda bir sonraki plaka kapağı kaldırmak için RoMa kullanın. Gelecek 3 levhalar için kaplama şeması kullanılarak devam edin. Kaplama tamamlandıktan sonra, 1,200 rpm Te-Shake ayarlanır ve dönüşüm karışımı homojen bir dağılım için, 1 dakika boyunca tüm plakaları çalkalayın. </li> MCA96 ve orijinal pipet uçları kullanılarak, geri kalan dönüşüm karışımı (pozisyon 13) daha sonra aspire 60 ul karıştırın ve 11 pozisyonunda da LB et suyu ihtiva eden DW96 içine dağıtın. Kültür havalandırma sağlamak için nefes yapışkan film ile DW96 ön kültür Seal. Maksimum hız O / N-(200/800 rpm orbital çalkalayıcı bağlı olarak) 37 ° C kuluçka makinesi içinde çalkalanarak bir yer. LB agar plakaları kuruyana kadar (10 dakika), kapalı onların kapaklı bir başlık olarak yerleştirilmelidir. Sonra da ertesi sabaha kadar 37 ° C inkübatör plaka tersine yerleştirilir. Ertesi gün, ön kültür otomatik indüksiyon ortamı içinde ve gliserol stoklarının hazırlanması için test ifade aşılamak için kullanılır. Bir yedek olarak, bir buzdolabında agar plakaları koyun. Gerekirse, agar plakaları veya gliserol stokları başlayarak, test ifade doğrudan taze LB ön kültür aşılamak tarafından yeniden yapılabilir. DW24 ZYP 2. Hazırlanması-5052 Tabaklar NOT: Bu prosedür 4x DW24 plakalarının her set için tamamlamak için yaklaşık 5 dakika sürer. Her bir bileşen için tarifler – 96 kültürler (464 mi ZY ortamı, 250 ul 2 M MgSO 4, 10 ml 50 x 5052, 25 ml 20x NPS, bu sırada her bir örnek için 500 ml ZYP-5052 otomatik indüksiyon ortamı Makyaj ) Tablo 1 'de verilmiştir, uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. Robot tezgahı hazırlayın: Konum 5 ve 6 iki 300 ml olukları, ~ 250 ml ortam içeren her bir koyun. Pozisyonlara 14-17 dört steril DW24 tabak koyun. 18'de 200 ul ipuçları koyun. MCA96 kullanarak ve 200 ul ipuçları, aspire 200 pozisyon 5 den ZYP-5052 ul ve 14 konumundaki ilk DW24 plaka içine dağıtın. Bunu yapın 5 kez (4 ipuçları toplam toplam kerede tek bir kuyunun içine dağıtmak olacaktır 4 ml). Pozisyonlarda kalan 3 x DW24 plakaları tekrar 15-17, switson iki DW24 plakaları 6 konumundaki ZYP-5052 Ching. Test Expression Kültürlerin 3. Aşılama ve Büyüme Not: Aşılama 4x DW24 plakalarının her set için tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürer ve büyüme O / N devam Robot tezgahı hazırlayın: Pozisyon 11'de (aşama 1.15 den) ihtiva eden ön kültür DW96 plaka koyun. Pozisyonlara 14-17 de (adım 2.3) ZYP-5052 ortamını ihtiva eden plakalar dört DW24 koyun. Şekil 5'te verilen şema kullanılarak deney sentezleme kültürleri (1/40 seyrelti) aşılamak için LIHA aspire 11 pozisyonunda ikinci ön kültür, 100 ul kullanılması. 96 oyuklu takip eden ön kültür, her sütun arasında yıkama istasyonunda iyice LIHA kafa yıkayın. Hava alabilir bir film ile kapatın ve DW24 plakalar 4 saat boyunca (200/400 rpm) çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin. Bu sırasında büyüme fazının süresi olan glucosortamdan e tercihen 27 tükenmiş olacak. 17 ° C sıcaklık azaltmak 4 saat ve glikoz tükenmesi sonra, laktoz Bu çalışmada 22, BL21 (DE3) pLysS veya Rosetta 2 (DE3) pLysS için en iyi büyüme koşulları sağlayarak, ifadesinin indüksiyonuna yol metabolize başlayacaktır. O / N ifade hücreleri bırakın Gliserol stokları sağlamak için geri kalan ön kültür kullanın. Gliserol Hisse 4. Hazırlanması Not: Gliserol stokları dondurucu arıza durumunda değişik yerlerde depolanacak üç kopya halinde yapılmalıdır. Robot tezgahı hazırlayın: Gliserol stokları ev 7 5 konumundaki mikrotitre plakaları koyun. 8 pozisyonundaki% 100 gliserol 50 ml dolu bir 300 ml oluk koyun. 11 pozisyonunda her bir (adım 3.2 sonra) ön kültürün 800 ul ihtiva eden bir DW96 koyun. 18'de 200 ul ipuçları koyun. Bir Clemenceau'ya kullanmaw aspirasyon ve dağıtım hızı, ön kültür içeren DW96 içine gliserol eklemek için MCA96 ve 200 ul ipuçlarını kullanın. Gliserol aspire 200 ul (pozisyondan 8). (11 konumundaki) 150 ul dağıtmak, sonra kalan gliserol ucunun alt ulaşmak için izin 20 saniye duraklama. Geri kalan 50 ul koyun. Bunlar, iyice karıştırıldı kadar aynı ipuçlarını kullanarak, 11 pozisyonunda DW96 içindeki kültür ve gliserol karıştırın. Gliserol nihai konsantrasyonu% 20'dir. Aspire 140 DW96 gelen ul ve 5 de birinci mikrotitre plakasının içine dağıtın. Kalan her mikrotitre plakası için adımı tekrar 4.3 (konumunu 6 ve 7). -80 ° C'de plastik yapışkan bant ve mağaza ile her bir mikro-titre plaka mühür Atmadan önce, bir antimikrobiyal madde ile dekontaminasyon, DW96 kalan kültür atın. 5.. Kültürlerin Büyüme değerlendirilmesi <p class = "jove_content"> NOT: Bu son OD 600 olarak nihai büyüme oranını değerlendirmek için genellikle gerekli değildir ancak büyümek değil herhangi kültürler dikkat edilmelidir, (bu koşullar 12 civarında) en kültürler genellikle aynıdır. (Adım 3.4) her bir kültürün 50 ul orta alın ve 150 ul ihtiva eden bir düz dipli, açık bir mikrotitre plakasının içine dağıtın. Dikkate 4-kat seyreltme alarak, OD 600 ölçün. Çok iyi büyümek değil ki eğer varsa, son tahlilde bu not. 6.. Hücreler Hasat NOT: Bu yordam Tamamlanması için yaklaşık 45 dakika sürer. 10 dakika boyunca 3.000 xg (adım 3.4) 4x DW24 plakaları santrifüj sonra antimikrobiyal ajan içeren bir atık kabı içine süpernatant atın. Herhangi bir aşırı orta kaldırmak için plakaları, baş aşağı, emici kağıt üzerine dokunun. Bu arada, 100 ml liziz hazırlamaktampon maddesi (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8, ya da tercih edilen diğer tamponu) lizozim (son konsantrasyon, 0.25 mg / ml) ihtiva etmektedir. Robot tezgahı hazırlayın: 5 de 300 ml teknedeki lizis tamponu koyun. Pozisyon 11'de bir temiz DW96 koyun. Pozisyonlarda 14-17 (adım 6.1), hücre topakları içeren 4 x DW24 plakaları koyun. 18'de 200 ul ipuçları koymak. MCA96 ve 200 ul ipuçları, aspire 5 pozisyonunda gelen lizis tamponu 125 ul kullanarak ve (pozisyonlar 14-17) Her DW24 plaka içine dağıtın. Tekrarlayın. Not: 4 uçlarına DW24 plakaların her bir 1 ml 'lik bir son hacim için, bir defada tek bir kuyunun içine dağıtmak olacaktır. Pelet tekrar süspansiyon 15 dakika boyunca Te-Shake (1000 rpm) kullanılarak 14-17 pozisyonları da plakalar çalkalayın. Topaklar yeniden süspansiyon haline kez (1, 14 de birinci DW24, ilk sütun) 4, ardından l kullanarak örneklerinden 550 ul aspire LIHA ilk 4 kanal kullanımıLIHA aspirat ast 4 kanal numune 550 ul 5 (birinci DW24 ikinci sütun) 8. 11 pozisyonunda DW96 ilk satıra koyun. Hücre süspansiyonunun tüm DW96 aktarılır, böylece adım 6.6 tekrarlayın. Numunelerin her set yıkama istasyonunda LIHA ipuçlarını yıkayın. Tekrar Şekil 5 içinde temin şeması kullanılarak her bir DW24 plaka içindeki her bir kolonu (pozisyonlar 15-17) için 6,6-6,8 yineleyin. Plastik film ile kapatın. Aynı gün ya da kısa süreli dondurma, 1 saat arasında, en az -80 ° C de saklamak, ilgili başka bir saflaştırma işlemi için -20 ° C'de saklayın Kısım B: Arıtma ve Analiz 7. Hücre Çözme NOT: Bu yordam tamamlamak için yaklaşık 60 dakika sürer. Bir a için çalkalama inkübatöründe yaklaşık 15 dakika ve tekrar süspansiyon için bir su (oda sıcaklığında veya 37 ° C) banyo (adım 6.10 'dan itibaren) dondurulmuş hücre süspansiyonları Çözülme10 dk LAVE F. Kültürler, viskoz olmalıdır. DNaz stokunun 500 ul alır ve MgSO 4 stokunun 1 ml ile karıştırın. El 8 kanallı pipet ile ya da robot LIHA ile, DNase 10 ug / ml ve 20 mM MgSO 4 nihai bir konsantrasyon vermek üzere, DW96 her kuyuya 15 ul dağıtmak. Plastik bant ile plaka yeniden mühür ve ilave bir 15 dakika boyunca çalkalanır. Bu noktada, kültürler, ağdalı olmayan olmalıdır. Tüm kültürler artık yapışkan olduğu (görsel inceleme ile) dikkatli bir şekilde kontrol edin. NOT: Bazı kültürler örnekler ve taşma veya toplam tıkanması üzerine bir düzensiz baskı üreten, hala (DNase yanlışlıkla bazı kuyularda uygun şekilde dağıtılan unutulmuş ya da değilse, örneğin), filtre yapışmasına neden olacaktır viskoz ise bu kritik, filtre plakası arıtma sırasında gerçekleşebilir. Bütün hücre lizatı, aspirat 10 ul lizat içeren ve 96 çukurlu bir PCR plaka içine tevzi SDS-PAGE için numuneler4x SDS-PAGE örnek tamponu içinde 10 ul su, 20 ul. 95 ° C'de 3 dakika boyunca denatüre ve analiz (Toplam fraksiyon) kadar dondurma. Bir HTP elektroforez sistemi varsa, bu numuneler yerine numune hazırlama için Üreticinin tavsiye protokolü aşağıdaki analiz edilebilir. Numunelerin analizi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bakınız: Bölüm 10. 8. Ni Affinity Arıtma NOT: Yavaş bir aspirasyon hızı tüm reçine süspansiyonlar pipetle için kullanılması gerektiğini, süspansiyonlar oldukça kalın olarak. Aşırı kurutma reçine bağlama kapasitesinde azalmaya neden olur. Saflaştırma için, belirtilen imidazol konsantrasyonları nikel afinite reçinesine uygulanabilir. Alternatif iyonları (örneğin, kobalt) kullanıldığı takdirde, daha sonra konsantrasyonlar göre ayarlanmalıdır. A – 1-100 mg / L aralığında tespiti için Ni afinite saflaştırma (son olarak reçine hacim = 200 ul) NOT: Tonun arıtma prosedürü, 4, bir gün içinde gerçekleştirilebilir, yani tamamlamak için yaklaşık 1.5 saat sürer. Robot tezgahı hazırlayın: Bağlama tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8), yıkama tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, pH 8) ile elüsyon tamponu (50 mM Tris, 300 mM ihtiva eden 300 ml olukları koyun pozisyonlarda NaCl, 250 mM imidazol, pH 8) 6-8, sırasıyla. Reçine harç için 5 konumundaki boş bir 300 ml çukur bırakın. Pozisyon 9 ve 10 koymak plaka sahiplerine de. 10 da üst SPE blok ve filtre / alıcı plakası (20 um) ile bir DW96 koydu. 14 konumundaki (adım 7.3) lisata içeren DW96 koydu. Pozisyonda 18 ve 19 de sırasıyla 200 ul geniş delik ipuçları ve 200 ul ipuçları koydu. Bir otelde yıkama ve sulandırma için iki yedek DW96 tabak koyun. NOT: Bir otel kullanılamaz Onlar da tezgahta bir alternatif sitesinde koymak olabilir. Hazırlayın 105dengelenen% 33 reçine bulamacı ml (35 ml reçine + bağlama tamponu 70 mi). Hemen prosedürü başlamadan önce 5 konumundaki çukur reçine süspansiyonu ekleyin. MCA96 ve 200 ul geniş delik uçları (pozisyon 18) kullanarak, iyice 14 de lizat içeren DW96 içine reçine bulamacı 200 ul aspirasyon ve dağıtma önce 5 de reçine, bulamaç karıştırılır. Iki kez tekrarlayın, böylece reçine bulamacı 600 ul Her bir aspirasyon önce, reçine süspansiyonu karıştırma, lizat eklenmiştir. Bağlanması için izin vermek için ve peletleme gelen reçine önlemek için 14 konumundaki MCA96 kullanarak, 10 dakikalık bir karıştırma aşamasını gerçekleştirir. Aspire pozisyon 14 ve her bir aspirasyon önce karıştırma, 9 konumundaki filtre plakasına (200 ul daha olarak) 800 ul ikinci dağıtım aksi durumda reçine, DW96 altındaki muhafaza edilecektir. Içine plâkasındaki lizat filtrelemek için, yaklaşık olarak 90 saniye boyunca 10 da üzerine yapılan vakum uygulaması açınDW96 reçine kurumasına özen, flow-through toplamak için. Vakumu kapatın. Reçinenin tüm filtre plakası daha sonra, böylece tekrar 8.1.5 ve 8.1.6 adımları tekrarlayın. RoMa kol sonraki yıkama adımı atığın doğrudan gider böylece 9 konumuna pozisyona 10 Filtre plakasını tutan SPE bloğunu taşımak ve bir otele, başka bir siteye (örn 10 konumundaki akış yoluyla içeren DW96 aktarmak kullanma prosedürün sonuna kadar taşıyıcı). (19 pozisyonunda) 200 ul ipuçları yeni bir dizi ile, (konum 6) bağlayıcı tampon 800 ul bir toplam (9 konumundaki reçine) yıkayın ve tampon geçti kadar 9 konumundaki vakum uygulamak . Bir kez daha tekrarlayın. 50 mM imidazol yıkama toplamak ve (konum 10) tekrar üstüne SPE blok ve filtre plakası taşımak için 10 konumundaki taze DW96 yerleştirmek için RoMa kolu kullanın. 10 pozisyonunda üzerine pozisyonda 7 yıkama tamponu 800 ul ekleyin, açıntampon içinden geçtikten kadar devam vakum. Vakum kapatınız. ROMA ile SPE blok ve filtre plakası 9 konumlandırmak ve otele yıkama örneği içeren DW96 kaldırmak ve prosedürün sonuna kadar bir kenara saklayın. Tampon geçirilir kadar (pozisyon 9 üzerine pozisyon 7) yıkama tampon maddesinin bir 800 ul reçine yıkanır, vakum uygulanır. Bir kez daha tekrarlayın. 10 konumundaki taze DW96 yerleştirin ve ayrışmanın toplamak için geri üstüne SPE blok ve filtre plakası yerleştirmek için RoMa kullanın. (9 konumundaki üzerine pozisyon 8) elüsyon tamponu 500 ul bir toplam ilave edin ve 3 dakika boyunca yerinde inkübe edin. Tüm tampon geçtikten kadar vakum açın. İsteğe bağlı: yüksek proteinleri ifade etmek için, ikinci bir elüsyon adımları 8.1.14 ve 8.1.15 olarak yeni bir DW96 halinde gerçekleştirilebilir. Numuneleri almak akan, SDS-PAGE elektroforez ve HTP için yıkama ve elüsyon / s. <lİçten-akış SDS-PAGE için numuneler i>, 4X SDS-PAGE numune tampon maddesi 10 ul su ve 20 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı PCR plaka içine 10 ul dağıtmak. Yıkama ve elüsyon SDS-PAGE için numuneler / s 4x SDS-PAGE örnek tamponu ihtiva eden 10 ul PCR plakalara 30 ul dağıtmak. 95 ° C'de 3 dakika boyunca denatüre ve analize kadar dondurma. HTP elektroforez numuneler için, üreticinin talimatlarına uyun. Numunelerin analizi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bakınız: Bölüm 10. B – 0.1-25 mg / L aralığında tespiti için Ni afinite saflaştırma (son olarak reçine hacmi = 50 ul) NOT: Bu saflaştırma prosedür 12'ye kadar bir gün içinde gerçekleştirilebilir, yani tamamlamak için yaklaşık 30 dakika sürer. Robot tezgahı hazırlayın: (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8), (, 50 mM imidazol, pH 8, 300 mM NaCI, 50 mM Tris) bağlayıcı tampon yıkama tampon maddesini ihtiva eden 300 ml olukları koyunve sırasıyla elüsyon tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8) pozisyonlarında 6-8. Reçine harç için 5 konumundaki boş bir 300 ml çukur bırakın. Pozisyon 9 ve 10 koymak plaka sahiplerine de. 10 da üst SPE blok ve filtre / alıcı plakası (20 um) ile bir DW96 koydu. 18'de anda. 14 konumundaki (adım 7.3) lisata içeren DW96 koyun ve 19 sırasıyla 200 ul geniş delik ipuçları ve 200 ul ipuçları koydu. Bir otelde, yıkama için yedek bir 96-çukurlu mikro-titre plaka koyun. Not: Bu aynı zamanda bir otel kullanılamaz ise tezgahta alternatif sitesinde koymak olabilir. Dengelenen% 25 reçine bulamacı (12.5 mi reçine + 37.5 ml bağlama tamponu) 50 ml hazırlayın. Hemen prosedürü başlamadan önce 5 konumundaki çukur reçine süspansiyonu ekleyin. MCA96 ve 200 ul geniş delik ipuçları (konum 18) kullanılarak, iyice aspire ve dispe önce 5 konumundaki reçine bulamacı karıştırın14 de lizat içeren DW96 içine reçine bulamacı 200 ul nsing. Bağlanmasına izin vermek üzere 10 dakika için 1400 rpm'de Te-Shake ile çalkalayarak oda sıcaklığında kuluçkalayın. Aspire pozisyon 14 ve 10 da filtre plakası üzerine geniş delik uçları (pozisyon 18) kullanılarak tam 1200 ul (200 ul daha olarak) dağıtmak. Her bir aspirasyon önce karıştırıp ikinci aksi durumda reçine, DW96 altındaki muhafaza edilecektir. Toplamak için DW96 içine plâkasındaki lizat filtre için yaklaşık 30 saniye boyunca 10 da üzerine yapılan vakum uygulaması açın akış yoluyla, reçine kurumasına özen. Vakumu kapatın. RoMa kolunu kullanarak, içine, bir sonraki yıkama adımı atığın doğrudan gider böylece 9 konumlandırmak ve akış yoluyla 10 konumundaki başka bir siteye (örneğin içeren DW96 aktarmak pozisyona 10 Filtre plakasını tutan SPE bloğunu taşımak otel taşıyıcı) prosedürü sonuna kadar. 200 μ ile(19 pozisyonunda) l uçları, (konum 6) bağlayıcı tampon 800 ul bir toplam (9 konumundaki reçine) yıkayın ve tampon geçti kadar 9 konumundaki vakum uygulanır. Tekrarlayın. 50 mM imidazol yıkama toplamak ve (konum 10) tekrar üstüne SPE blok ve filtre plakası taşımak için 10 konumundaki taze DW96 yerleştirmek için RoMa kolu kullanın. , Konum 10 üzerine pozisyon 7, her yıkama tampon 150 ul tampon geçirildi kadar üzerinde vakum açın. Vakum kapatınız. ROMA ile 9 konumlandırmak için SPE blok ve filtre plaka kaldırmak ve otele yıkama örneği içeren DW96 ve prosedürün sonuna kadar bir kenara saklayın. Tampon geçirilir kadar (pozisyon 9 üzerine pozisyon 7) yıkama tampon maddesinin bir 800 ul reçine yıkanır, vakum uygulanır. Tekrarlayın. 9 konumundaki mikroplağı yerleştirmek için RoMa kullanın ve inci toplamak için geri üstüne SPE blok ve filtre plakası yerleştirine elüsyon. (9 konumundaki üzerine pozisyon 8) elüsyon tamponu 190 ul ilave edin ve 3 dakika boyunca yerinde inkübe edin. Tüm tampon geçti kadar vakum uygulayın. SDS-PAGE elektroforez ve HTP için akan, yıkama ve elüsyon örnekleri al. İçten-akış SDS-PAGE için numuneler, 4X SDS-PAGE numune tampon maddesi 10 ul su ve 20 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı PCR plaka içine 10 ul dağıtmak. Yıkama ve elüsyon SDS-PAGE için numuneler / s 4x SDS-PAGE örnek tamponu ihtiva eden 10 ul PCR plakalara 30 ul dağıtmak. 95 ° C'de 3 dakika boyunca denatüre ve analize kadar dondurma. HTP elektroforez numuneler için, üreticinin talimatlarına uyun. Numunelerin analizi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bakınız: Bölüm 10. 9. Tag yarılması (İsteğe bağlı) 8.1.15 aşama (ve 8 den elüte protein (TEV proteaz ile (2 mg / ml) eklenir.1/10 oranında 1.16) veya aşama 8.2.14) (v / v). RT (ya da ısı duyarlı proteinler için 4 ° C) hafif sallama ile O / N inkübe edin. Bölünme sonunda 10 4x SDS-PAGE örnek tamponu ul veya HTP elektroforez numune için Üreticinin talimatları izleyin içeren bir PCR tabak içine 30 ul dağıtmak. 96 çukurlu bir 0.22 um filtre levhası boyunca (adım 9.2) geri kalan bölme karışımı filtre ve toplamak, çözünür-akış bir DW96 olarak vakum uygulanarak. Bu, Bölüm 8.1 ve 8.2 'de yıkama adımları için olduğu gibi, sıvı taşıma robot vakum sitelerden biri (örneğin, konum 10) yapılabilir. Bu bölünme sırasında çöken herhangi bir protein kaldırır. Filtreleme işleminden sonra, 4x SDS-PAGE örnek tamponu içinde 10 ul ihtiva eden bir PCR plakasına 30 ul, dağıtılması veya HTP elektroforez numune gibi hazırlandı. Bu sayede ayrılmasından önce, proteinin karşılaştırması, yarılma ve sol sonra karışım,uble protein bölünmesinden sonra kalan ve sonraki ölçek-up deneylerde beklenen sonuçların iyi göstergeler veriyor. Numunelerin analizi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bakınız: Bölüm 10. Sonuçların 10. Analizi SDS-PAGE, bu tür kaliper LabChip olarak nokta leke veya HTP elektroforez sistemi üzerinde saflaştırma numunelerinin analiz edilmesiyle çözülebilir proteini ifade yapıları tanımlamak. Çözülebilir protein üreten yapıları tanımlamak Birinci elüsyon örnekleri analiz edin. Çözünür yapıları tanımlanır Çoğu durumda sadece elüsyon numuneleri analize harcanan zamanı en aza indirmek için, analiz edilir. Protein, yıkama değilse, bu ifade edildi ve reçinesine doğru bağlanmayan eğer yıkama ve akış-through örnekleri görmek çalıştırın. Hiçbir çözünür protein protein ifade edildi olmadığını görmek için Çalıştır tüm hücre lizatının tespit edilebilir yapıları için. NOT: Burada bir sınırlama olduğunu eğer pilgi K'e yukarıda arka ifade seviyeleri mevcut değil, bu protein görmek mümkün olmayabilir ve yanlış negatif yol açabilir. Bu proteinler sopa ve afinite reçine üzerine çöken ve bu yanlış negatif ya da altında kestirimi önerilen protokolü (bu çalışmada nadir bir olay) kullanarak verim neden olabilir için her zaman mümkün olduğunu belirtmek gerekir. Protein (beyaz topak bir kaç dakika / saat yıkamadan sonra görünür) elüsyon üzerine çökeltileri olması durumunda bu bileşim bir tampon (örneğin, tuz konsantrasyonu) değiştirmek ve / veya optimize etmek için bir diferansiyel tarama florimetre deneyi gerçekleştirmek için önerilir tamponlar. Reçinenin küçük bir örnek de SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve bir protein, reçine üzerinde tutulan olup olmadığını tespit etmek için haşlanmış olabilir. Protein ifade değildi ama OD 600 regrow ve kültürünü reanalyze yeterince yüksek değildi hücreler büyür, yeni bir anlatım stratejisi izlemeye, ya da olmadıysa. </li> Yarılma örnekleri analiz edilmesi için ise, her yapı, analizi basitleştirmek için, kesimden önce bir bitişik şerit bölünmesinden sonra gösterilebilir, böylece, bunlar yan yana bir şekilde analiz edilmesi gerekmektedir. Elüsyon konsantrasyon doğrudan ölçümü sağlayan bir yöntem kullanılarak sürece, miktar 280 nm'de (A280) de absorbans ölçülerek pozitif numuneler için gerçekleştirilmelidir. En yüksek ifade veren çözünür yapıları tanımlamak amacıyla protein verimi bir tahminini sağlamak için, dikkate proteinin eş verimli yok olma alma ve bir boşluğu ile elüsyon tamponu kullanılarak, A280 ölçün. Çözünür verimleri en güvenilir Karşılaştırma için, Bölüm 5 alındı ​​(OD 600 ölçümü kullanılarak) kültür yoğunluğu ile verimlerini normalleştirmek için tavsiye edilir. Tüm kültürler, yaklaşık olarak aynı yoğunluğa değin büyüdü ise, normalleştirme değil gereklidir. e "> 11. Kalite Kontrol Örnekler sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC / MS) ile, yıkama veya bölünme numuneden direkt olarak analiz edilebilir. Seçenek olarak ise, ZipTip pipet uçları ya da sıvı kromatografi yöntemlerle (imidazol ve mevcut olabilecek herhangi bir tampon tuzları çıkarmak için) ilk olarak tuzunun giderilmesi, daha sonra matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight (MALDI-TOF) ya da elektrosprey iyonizasyon (kullanarak analiz ESI) kütle spektrometrisi. Küçük ölçekli fonksiyonel çalışmalar, beklendiği gibi, proteinin fonksiyonu olup olmadığını kontrol etmek için gerçekleştirilebilir. Büyük miktarlarda fonksiyonu için gerekli ise, bir ölçek-up kültürü yapılabilir ve büyük kültür boyutu ve oksidasyon devlet bir kez gelen test işlevi küçük ölçekte teyit edilmiştir.

Representative Results

Örnek sonuçlar VENOMICS boru hattından 96 disülfid açısından zengin proteinlerin ifadesi taranması için, Şekil 6'da gösterilmiştir. Proteinler kalıntılarının sayısını artırmak disülfid bağların artan sayıda düzenlenir. Peptitler, bir His-tag ve DsbC füzyon ortağı ile sitoplazma içerisinde ifade edilmiştir. Tavsiye edilen kültür koşulları kullanırken, 12 bir OD 600 normal olarak elde edilir. Peptidler, nikel afinite reçinesi 50 ul nihai hacim ile protokol 8.2-B kullanılarak saflaştırılmıştır, bu ~ 25 mg / L füzyon proteininin maksimum Bu deneyde tespit edilebilir. Şekil 6A, kaliper LabChip sistemi (ayrılmasından önce, füzyon gösteriliyor) ve füzyon proteinin mg / L kültür elde etmek için ekstrapolasyon dayalı skorlama sistemi (0,1-2 mg / L kültür seviyelerinde, 2 den elektroforez sonuçlarını gösterir 10 mg / L kültür, 10-25 mg / L kültür no t algılandı.) beklendiği gibi yarılan DsbC etiketi normalde yerine 27 kDa'dan, yaklaşık 32 kDa'da çalıştığını unutmayın. Benzer şekilde, DsbC füzyonları da beklenenden daha yüksek bir yaklaşık 5 kDa çalıştırın. Hedeflerin bir sürü için biz sağlam füzyon (üst bant) görmek değil sadece, aynı zamanda füzyon partneri yalnız (alt bant). Bu hedeflerin bazıları için kültür koşulları optimize tek başına DsbC nihai verimle bir artış sağlayan kıyasla bozulmamış füzyon (üst band) oranını artırabilir. Skorlama sadece sağlam füzyon seviyesine dayanmaktadır. Sadece 16 96 dışında proteinler füzyon düzeyde tespit edilememiştir. Bu% 83 genel başarı düzeyine karşılık gelmektedir. Algılanabilir 80 proteinleri arasında, bunlardan 45 2 mg / L kültür (% 56) daha yüksek düzeylerde tespit edildi. (Bu örnekte protokol 8.2 B ~ 25 mg / L füzyon proteininin en fazla tespit edilebilir kullanılarak olsa da) hedef ve füzyon bağlı olarak, protein verimleri 2-100 mg / L kültür aralığında genellikle. t "> mevcut disülfür bağlarının sayısı (Şekil 6B gösterilen) tarafından başarı analizi düşük başarı düzeyi 6 disülfit içeren hedefler için% 66 olmak üzere, (1 ve 7 arasında) test disülfit bağlarının tüm numaralar için makul bir başarı gösterir bağlar. izoelektrik noktası ve artıklarının sayısı (Şekil 6C'de gösterilmektedir) göre ifade başarı dağılımının bir analizi her iki başarılı bir şekilde eksprese hedefleri ve arsa dağılmış saptanmamış hedefleri, teknik için belirli bir sapma gösterir. Şekil 6D DTT ile örnek indirgenmesi önce ve sonra, tek bir hedef için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi (ESI-MS) için elde edilen kütle spektrometresi sonuçları bir örneğini göstermektedir. Normal olarak, böyle bir kapsamlı kütle spektrometrisi analizi, ancak tam bir demonstratio amaçları için, (düşük bir örnek analiz edilmesi gerekir değil) gerçekleştirilmesi gerekir olmazn biz sonuçlar hem göstermiştir. Gösterilen hedef 4, disülfür bağları ile bir 5.7 kDa disülfid zengin zehir proteindir. Soldaki spektrumu bundan başka müdahalesi olmadan bölünmesi ve tuz giderme sonra olduğu gibi, önce DTT ile indirgeme için protein için sonuçları göstermektedir. Sağ taraftaki spektrumu herhangi bir fazla DTT çıkarmak için tuzunun giderilmesi, ardından DTT ile indirgemeden sonra proteini göstermektedir. Deney kitlelere karşılık gelen iyonların her biri iyonu için spektrum ve belirlenmesi ile ilgili oklarla işaretlenmiştir yeşil gösterilir. Bu iyonlar için hesaplanan deneysel ebeveyn kütlelerin (proteinin için ön indirgeme (= DTT) ve indirgeme (+ DTT) sonra) tabloda gösterilmiştir. Kitleler 8 Da'lık bir kütle farkı gösterirler (önce indirgenmesi ve indirgenmiş numune için 5717,6 Da örnek için 5709,6 Da). 2 Da'lık bir kütle farkı, 1 oksitlenmiş disülfid bağının varlığında karşılık gelen (beklendiği gibi), bu nedenle 8 Da'lık bir kütle farkı 4 disülfid bağların varlığına işaret olarakindirgenmemiş örneği. Açıklanan yarı otomatik ekipman ile yüksek verimlilik ifade tarama protokolü Şekil 1.. Şematik., Bu protokolü kullanarak, 96-384 koşulları manuel yöntemlerle bir hafta içinde tek bir kişi tarafından test edilebilir, ya da en fazla 1.152 koşullar. İfade plazmidleri çok sayıda hedef bir seferde alt klonlanabilir, böylece rekombinant klonlama teknolojisi kullanılarak inşa edilmektedir. Bir kez çözünür ifade koşullar belirlenmiş ve gerçekleştirilen bölünme, istenirse, protein oksidasyonunu ve saflık, microassays ve / veya büyük ölçekli üretim kontrol etmek için kalite kontrol devam edebilirsiniz. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = "500" /> Şekil 2,. Genel rekombinasyonel klonlanması için şematik ve tasarım oluştururlar. Hedef giriş klonlardan, çoklu ekspresyon vektörleri, bir yüksek verimli bir şekilde (bir hafta kadar 6 x 96 giriş klon) ve tek bir deneyde alt klonlanabilir. Ifade edilen protein, nikel afinite saflaştırılması için bir HIS etiketi kodlar. DsbC (sitoplazmik ifade için periplazmik sinyal dizisini içermeyen) füzyon partneri, çözünürlük ve / veya yardım katlama ve hedef proteinin doğru oksidasyonunu artırmak için kullanılır. Etiket bölünme isteniyorsa hedef kodlama dizisi, bir N-terminal TEV proteaz sitesi (ENLYFQ) içermesi gerektiğini not edin. Sol üst ek PCR ya da gen sentezi ile elde edilebilir bir verici vektör ve hedef sekansları kullanılarak giriş klonlarının üretimi gösterilmektedir. Entry klonlar da ticari giriş klon koleksiyonlarından elde edilebilir. Birden rekombinasyonel klonlama sistemleri mevcuttur, ancak biz Geçidi syste kullanmakm, şemada gösterildiği gibi. Birden çok disülfid zengin hedefler için Şekil 3,. Yüksek verimli tarama hattı. Hedefleri ilk BL21 (DE3) pLysS E. sitoplazmasında HIS-DsbC füzyonları olarak ifade edilmiştir oto-indüksiyon ortamı (ZYP-5052) kullanılarak 37/17 ° C coli. Saflaştırma HTP elektroforezi (veya nokta lekeleme / SDS-PAGE ile birlikte) ile çözünür konstruktların saptanması, ardından nikel reçinesi üzerinde gerçekleştirilir. Ifade tarama ilk turda başarısız olursa, alternatif kültür koşulları çalışılmıştır. Yapılar, yeterince yüksek verim, microassays ve kalite kontrol çözünür proteinlerin üretilmesi durumunda gerçekleştirilebilir ve gerekirse, büyük ölçekli üretim takip edilebilir. Çözünür verimleri yeterince yüksek değildir hedefler için, ifade tarama alternatif stra ile devam edebilirsinizins ve sonra sıcaklıklar diğer füzyon ortakları ve periplasmik ifade. İsteğe bağlı adım noktalı kutularla gösterilir. HTP platformu için Şekil 4.. Robot Worktable kurulum. Alternatif işyerleri de kullanılabilir olmasına rağmen bizim sıvı taşıma robot tezgahının düzeni gösterilir, mevcut eşdeğer siteler bulunmaktadır sağladı. Kur (8-kanal, sıvı taşıma kafası (LIHA)), 4 pozisyonları ile iki mikrotablaya taşıyıcıların her (MP4, 1-4 ve 5-8 pozisyonları), 2 pozisyonlu bir vakum istasyonu için bir yıkama istasyonu (WS) oluşur Bir taşıyıcı (Te-Çalkalayıcılar 14-15 ve 16-17 pozisyonları) 2 pozisyon iki plaka karıştırıcısı her 3 pozisyonlu bir mikrotablaya taşıyıcı (MP3, 11-13 pozisyonları), (Te-elektrikli süpürgeler, 9 ve 10 pozisyonları) ve 3 pozisyonları ile tek ipuçları (DITI, 18-20 pozisyonları). Ek olarak,Yeniden iki otel derin kuyu plakaları için olan taşıyıcılar ve (gösterilmemiş olan) için, bir mikro bulunmaktadır. Sıvı taşıma robot yüklü donanım tek kullanımlık uçları, etrafında tabaklar / ekipman hareket sabit ipuçları ile 8-kanal, sıvı taşıma kafası (LIHA) ve bir robot manipülatör (RoMa) ile kullanmak için bir 96-kanallı kol (MCA96) olduğunu çalışma tezgahı. Kutup numaralandırılması protokol boyunca adlandırılır. Şekil 5,. Dört adet 24 oyuklu plakalar tek bir 96-yuvalı plaka aktarmak için şematik. Şekil 6.. Temsilcisi sonuçları 96 disülfür zengin zehir pro ifadesi ekran için gösterilirproteinlerden. Proteinler sitoplazmada HIS-DsbC füzyonları olarak ifade edilir ve nikel reçinesi 50 ul (Protokol 8.2-B) kullanılarak saflaştırılmıştır. A) ifade tarama sonucu, sanal jel gösteren ve ifade verimi için puanlama. Sanal jel kontrast çok soluk veya yoğun bantları telafi etmek için şerit-to-şeritli ayarlandı. Bazı hedefler için iki bant üst bant disülfid bağların sayısı ile karşılaştırıldığında). B, tek başına füzyon etiketine karşılık gelen bozulmamış füzyon proteini ve alt bant için her ekspresyon seviyesinde ifade edilen proteinlerin oranı karşılık gelen görülebilir unutmayın protein. Her gruptaki proteinlerin gerçek sayısı grafik. ° C) üzerine yerleştirilmiştir, izoelektrik noktası (pl) ve kalıntıların sayısına göre ekspresyon düzeylerinin dağılımı. D), bir 5.7 kDa disülfid zengin zehir için kütle spektrometresi sonuçları örnek 4, disülfür bağları ile protein. Üzerinde spektrumSol taraftaki önce DTT ile indirgeme ve sağ taraftaki spektrumuna protein DTT ile indirgendi ve daha sonra tuzu giderilir protein sini göstermektedir. Deney kitlelere gelen iyonları oklarla işaretlenmiştir ve atamaları yeşil gösterilmiştir. Indirgemeden önce ve sonraki indirgeme tabloda gösterilen ve indirgeme maddesi ilave edilmeden önce okside protein varlığında tekabül eden, 8 Da'lık bir kütle farkı sergileyen olan proteini için deneysel kütleleri. bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın . Bileşen Yemek tarifi Yorum ZY ~ 928 ml 10 g tripton 5 g maya hülasası 925 ml su Mix ve daha sonra sterilize etmek için otoklav. </tr> 2 M MgSO 4 100 mi 49.3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml su Çözülene kadar karıştırın sonra sterilize etmek için otoklav. 50x 5052 1 L 250 g gliserol 730 ml su 25 g glukoz 100 g α-laktoz , Sırayla Ekle eriyene kadar ısı boyunca karıştırıldı daha sonra sterilize etmek için otoklav. 20x NPS 1 L 900 ml su 66 g (NH4) 2 SO4 136 g KH 2 PO 4 142 g Na 2 HPO 4 Sırayla ekleyin ve bütün çözülmüştür sterilize etmek için otoklav kadar karıştırın. ZYP-5052 ortam bileşenleri için Tablo 1 '. Tarif.

Discussion

Çözünür, katlanmış, fonksiyonel proteinlerin ifadesi için tek bir genel protokol vardır. , Maliyet ve zaman verimli çoklu hedefleri ile çalışan en laboratuarlar veya protein çekirdek tesisleri nedenle hedeflerin çoğunluğu için çözünebilir aktif bir protein elde etmek için değişkenlerin en iyi 'genel' kombinasyonunu bulmak için tarama yüksek verimlilik protein ifadesini kullanın. Biz, disülfid zengin peptidler ve proteinler 11 çözünebilir ifadesi için genel olarak uygulanabilir bir füzyon ortağı olarak DsbC belirledik. DsbC füzyonları ve yüksek verimli yöntemler kullanılarak, bir hafta içinde birden fazla hedefin çözünebilir ifadesi 11 gözlenebilir ve daha sonra, giriş kısmında ele alınanlar gibi ek değişkenler, daha fazla optimizasyon gerektiren hedeflere sonraki turda taranabilir. Burada tarif edilen protokoller disülfid bakımından zengin proteinler ve peptidlerin ifadesi yöneliktir. Ancak, kullanıcılar için exp isteyenbir yüksek verimli bir şekilde Arş olmayan ağ gibi örülmüş proteinleri, karşılık gelen protokollerin daha önce yayınlanmış olan ve başka bir yerde 22,24 bulunabilir.

Yüksek verimli kurulum çözünebilir ifadesi ya da aynı anda birden fazla hedef gen için (çeşitli füzyon etiketler de dahil olmak üzere) bir ekspresyon yapıları, çok sayıda taranması için farklı proteinlerin büyük sayıda taranması dahil olmak üzere, bir dizi uygulamalar, (için idealdir veya birden fazla ifade başarı oranlarını artırmak için tek bir hedef) için oluşturur. Platform ayrıca hedeflerin çok sayıda yeni protokollerin kıyaslama ve doğrulama için kullanılabilir. Diğer uygulamalar, tek zor bir hedef için varyantların tarama, örneğin, tüm ortologlarını veya aynı aile üyeleri, ya da bir deneyde, tek bir hedefin mutantlarının bir panelinin üretimi başarısını test etmek için bulunur. Bu protokol, aynı zamanda ortak-sentezleme vektörleri (wit ile bir arada kullanılmaktadırh bir aşağı çekme ve doğru kompleks oluşumu ve stokiyometrisinden 33 onaylamak için daha kapsamlı biyofiziksel analizi takip protein-protein komplekslerinin ön karakterizasyonu izin) sadece protein etiketledi. Saflaştınldı protein miktarı, mikro-analizleri (fonksiyonel testler, protein-DNA 34 veya protein-protein etkileşimi deneyleri) bazen uygundur. Yüksek verimli sentezleme tarama stratejisi için bir çok avantajı vardır: (i) hedef, çok sayıda test yeteneği ya da tek bir deneyde değişken çok sayıda, (ii) sınırlı partiden partiye değişkenlik, (iii) basitlik ve (v) otomasyon potansiyeli ve izleme (vi), basitlik, daha büyük bir ölçekte, derin kuyular, (iv) ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirliği ile daha küçük bir ölçekte çalışan ve bireysel tüplerin (no etiketleme, daha az işleme kolaylığı ) karıştırma bireysel tüplerin kullanımı ile daha plaka formatı kullanılarak veya klonlarının değişiminde ortaya hatalar.

<pclass = "jove_content"> protokol bölümde ele birlikte, aşağıda kısaca ele alınacaktır deney hazırlanması için, pek çok önemli hususlar bulunmaktadır. Daha ayrıntılı bir tartışma için, önceki yayın 24 bakın. Maksimum verimlilik için, bu hedeflerin çok sayıda alt-klonlama kolaylaştırmak için, yüksek verimli klonlanması için uygun bir sistem olması faydalıdır. VENOMICS Projenin ilk aşamasında, biz haftada klonların yüzlerce bir tempoda herhangi bir hedef vektörü olarak subklonlama verir yönlü Geçidi rekombinasyon sistemini 25 kullanmaktadır. Ağ Geçidi rekombinasyon klonlama için Protokoller Invitrogen web sitesinde bulunabilir. Yüksek verimli klonlanması için diğer alternatifler 37 klonlama ligasyon bağımsız klonlama (LIC) 35,36 ve kısıtlama içermeyen (RF) içerir. Giriş klon koleksiyonlarından, şablon DNA'dan PCR ile dahil olmak üzere, ekspresyon için hedef genlerin elde edilmesi için birden çok yolu vardır ya daVENOMICS proje için seçilen strateji sentetik genler,. Sentetik genlerin gen ve gen sentezi her iki ucundaki rekombinasyon ile birlikte sipariş edilebilir Hedef gen dizisinin kolay kodon optimizasyonu (nadir E. coli kodonu hariç) sağlar. Bu önerilir, ancak gerekli değildir. Nadir kodonların yüksek bir sayı, Rosetta 2 (yüksek derecede E. coli içinde ifade edilmeyen ender kodonlar için tRNAs taşır) (DE3) pLysS içeren kodon optimizasyonu olmadan hedefler için BL21 (DE3) pLysS daha uygun olabilir. Sitoplazma normal indirgeyici çevrede disülfid bağların azaltılması sınırlamak suşları olsa da, elimizdeki düzenli E kadar başarılı olmamıştır coli suşları 11.

Analitik ölçek afinite saflaştırma çözünebilir füzyon proteinleri geri ve verimleri ölçmek amacıyla test sentezleme kültürlerden gerçekleştirilir. Nicel veriler inci elde edilebilirkültür, 100 mg / L – 0.1 aralığında ifade edilen füzyon proteinlerinin çözülebilir e verimleri. Hedef çözünür değilse, farklı füzyon ortakları takip önce, alternatif ifadesi ve indüksiyon sıcaklıkları suşları veya ortam test edilebilir. Disülfid açısından zengin proteinlerin çözülebilir ekspresyonu için, daha önce ifade sitoplazmik 11 DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-etiketi olarak füzyon ortaklarının etkisini sırada yer almaktadır. Periplazma ifadesi disülfid zengin hedeflerin başarılı katlanmasına yardımcı olabilir başka bir olasılıktır. Periplazma sitoplazmada daha az indirgeyici ortam ve disülfid bağ yardımcı olmak için kullanışlı redoks şaperonlar içerir. DsbC, DsbA ve MBP periplazmik proteinlerin normal olarak sinyal dizileri ile periplazma lokalizedir. Bu katlama yardımcı olmak amacıyla, periplazmik boşluğa disülfid zengin hedefleri doğrudan bu etiketleri yararlanmak için bir fırsat sağlar. Inatçı hedefler için, bir sonraki adım p olacaktır(bu protokol kapsamı dışında olan ve burada 3 9 ele olmayacak), çözünmesi ve katlanamayan, katma gövdelerinden çözünmeyen HIS-etiketli hedef urify. Bu, yalnızca bir ya da iki disülfid bağları ile hedefler için oldukça basit olabilir, ama disülfid bağları sayısı arttıkça giderek daha zor hale gelir olabilir. Seçenek olarak ise, özellikle dört veya daha fazla disülfür bağları ile protein ve peptidler için, bu tür maya, böcek ya da memeli ekspresyon gibi daha karmaşık üretim sistemleri denemek için yararlı olabilir.

Minyatür ve otomasyon gelişmeler ile, HTP elektrofizyoloji lab-on-a-chip teknolojileri 28 şüphesiz fonksiyonel analizler için geleceğin yol olacaktır. Biz, (belki de yapısal çalışmaları hariç) bu büyük ölçekli kültürler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır doyurmaya çok amaç için düşünüyoruz. Küçük çaplı kültürler sentezleme koşulları taranması için faydalı değil, aynı zamanda mak, sağlamak mümkün olmazficient Bu minyatür işlevsel tahliller için örnek tutarındadır. Fonksiyonel karakterizasyonu için yeterli miktarlarda paralel olarak birden fazla hedefin üretme yeteneği kültürlenmesi ve platformlar, bu tür kullanarak maliyetlerini düşürür, rekombinant proteinlerin ekspresyonu ve karakterizasyonu daha fazla maliyet ve zaman etkili olacaktır.

Protokoller, burada 7. Çerçeve Avrupa VENOMICS projesinin başlangıç ​​aşamasında disülfid zengin peptidler ve proteinlerin ekspresyonu için uygulanmıştır. Zehirleri ilginç genellikle farmakolojik potansiyeline sahip biyoaktif peptitler mükemmel bir kaynağıdır. Bununla birlikte, bunların üretimi nedeniyle karmaşık disülfür bağ kalıpları ve küçük bir boyuta zordur. Burada tarif edilen gibi yüksek verimli platformları kullanarak, VENOMICS proje doğada görülen çeşitliliğini yeniden üretmek için 10,000 yeni venom peptidleri içeren bir kitaplık oluşturmak için amaçlamaktadır. Bu kütüphane, disülfid-r karakterizasyonu için yararlanılabilir doyurmayayeni ilaçlar geliştirmek amacıyla olası farmakolojik veya terapötik uygulamalar ile ich peptidler. Platform şu anda VENOMICS projesinde kullanılmak üzere yeni protokoller kıyaslama ve doğrulamak için kullanılan ediliyor.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma VENOMICS projesi, Yedinci Çerçeve Programı (FP7 SAĞLIK 2011-2015) aracılığıyla 278.346 ° Avrupa projesi hibe N tarafından desteklenmiştir. VENOMICS proje Avrupa'nın çeşitli araştırma kurumları ve şirketler arasında bir işbirliği olduğunu:

AFMB, Aix-Marseille Université (Fransa), CEA Saclay (Fransa), NZYTech (Portekiz), SistemasGenomicos (İspanya), Üniversite de Liege (Belçika), VenomeTech (Fransa), Vitamib (Fransa), Zealand Pharma (Danimarka)

Bu çalışma Entegre Yapısal Biyoloji (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01 için Fransız Altyapı tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar ayrıca video çekim için hazırlıkları ile yardım için Sayın Jeremy Turchetto teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 °C. Use a 1 in 1000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One  780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator 
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570
http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity  Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600nm of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4
http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 .
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R., Chen, Y. W. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. 1091, 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. . Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1′ specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Tags

High ThroughputQuantitative Expression ScreeningRecombinant Disulfide-rich Venom ProteinsE. ColiStructural GenomicsDsbCDisulfide Bond FormationProtein ProductionTherapeutic Drug LeadsVenom ProteinsMass SpectrometryMicro-assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image