JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em> Е. палочка</em

Published: July 30, 2014
doi:
10.3791/51464
, , ,
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB),Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d’Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO),Commissariat à l’énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

Summary

Протокол для количественного выражения, высокой скрининга и аналитической очистки слитых белков из мелких кишечной палочки культур описано и наносили на экспрессию богатых дисульфидных целей животное яд белка.

Abstract

Кишечной палочки (E.coli) является наиболее широко используемой системой экспрессии для продукции рекомбинантных белков для структурных и функциональных исследований. Тем не менее, очистки белков иногда сложно, так как многие белки экспрессируются в нерастворимую форму. При работе с трудными или нескольких целей поэтому рекомендуется использовать высокую пропускную способность (HTP) скрининга экспрессии белка в небольших масштабах (1-4 мл культуры), чтобы быстро определить условия для растворимого выражения. Для того чтобы справиться с различными структурными геномики программ лаборатории, количественный (в диапазоне 0,1-100 мг / л культуры рекомбинантного белка) и HTP белок протокол скрининга выражение был реализован и утверждена тысяч белков. Протоколы были автоматизированы с использованием жидкой обработки робота, но также могут быть выполнены вручную без специального оборудования.

Дисульфидные богатых протеины яда набираютвсе более широкое признание за их потенциала в качестве терапевтических приводит наркотиков. Они могут быть очень мощным и селективным, но их сложные сети дисульфид облигаций сделать их сложно производить. Как член проекта FP7 Европейской Venomics ( www.venomics.eu ), наша задача заключается в разработке успешных стратегий производства с целью получения тысячи новых белков яда для функционального характеристики. При содействии окислительно-восстановительные свойства изомеразной дисульфидная связь DsbC, мы адаптировали наши производственные ПВТ трубопровод для выражения окисленных, функциональных яда пептиды в Е. палочка цитоплазма. Протоколы, также применимы к производству разнообразных дисульфидных богатой белками. Здесь мы показываем, наш трубопровод применяется для производства животных ядов белков. С описанные здесь протоколы вполне вероятно, что растворимые дисульфидные богатой белками будут получены в качестве лишь неделю. Даже из небольших масштабах, существует возможность использовать йэ очищенных белков для проверки состояния окисления методом масс-спектрометрии, для характеристики в пилотных исследований или для чувствительных микро-анализов.

Introduction

Руководствуясь продвижения геномики и ускоренными темпами открытия новых белков, высокую пропускную способность трубопроводов были разработаны для распараллеливания традиционные подходы для скрининга и идентификации оптимальных стратегий производства белка. Потенциальные переменные, которые будут оптимизированы, включают, но не ограничиваются различными выражение штаммы 1,2, температура 3,4, СМИ 2,3, целевая варианты 5, Фьюжн партнеров 6-13, коэкспрессии с сопровождающим 14,15, цитоплазматический или периплазматической экспрессии 16-18, и буферные очистки компоненты 3. Реализуя высокие подходы пропускной, многие переменные или многие цели могут быть проверены параллельно с высоким уровнем эффективности, при ограничении партии к партии вариации. По нашему опыту, стратегия также дает хорошую воспроизводимость По масштабов, используя тот же культуру (температуры, СМИ, аэрация и др.) и условия очистки (же житеN, буферы и т.д.). Несколько высокой пропускной платформы были использованы в последнее десятилетие, чтобы определить условия для выражения растворимого белка, а именно через различных параметров, таких как партнеров слияния, деформаций выражения или температуры 19-23.

Недавно мы использовали наш высокопроизводительного скрининга подход для выражения растворимых дисульфидных богатых белками 11. Белки были выбраны не только от ядовитых источников, но также включены дисульфидные богатых ингибиторы ферментов из широкого круга видов растений, включая, свиней, коров и человека. Эксперимент сравнили эффекты 12 различных партнеров слияния и трех различных штаммов выражения по растворимости и складывания 28 дисульфидных-сетчатые белков. Мы показали, что с помощью DSBC виде слитого партнера для производства в штамме BL21 (DE3) pLysS значительно outproduced (как в урожайности и количества растворимых белков, полученных) любая другая комбинация деформации и слияния испытания 11.Результаты этого эксперимента послужили основой для адаптации наше первоначальное общее высокую пропускную способность трубопровода (который был использован для скрининга экспрессии широкого спектра белков) 22,24 в одну больше подходит для экспрессии богатого дисульфидных целей. Дисульфидные богатых белки из ядов животных представляют особый интерес. Яды собой сложную смесь биологически активных пептидов и белков с потенциальную ценность фармакологически и терапевтически. Тем не менее, выражение дисульфидных связей, содержащих белков не является тривиальной. Эти белки обычно содержат от 6:59 дисульфидных связей, и должны быть окислены с правильными шаблонов дисульфид-склеивания, чтобы быть активными. В настоящее время, платформа используется для скрининга на экспрессию большого числа дисульфидных богатых животных ядов белков в рамках европейского проекта FP7 VENOMICS (www.venomics.eu) и тестирования новых протоколов для высокой пропускной экспрессии тысяч целей . Здесь, автоматизированный методпредусмотрено высокой пропускной малого скрининга экспрессии и очистки (см. рисунок 1) применяется к дисульфид богатых яда белки животного происхождения. Стратегия дисульфидных богатых пептидов и белков использует His-тэг для очистки и окислительно-восстановительной активностью партнера слияния, DsbC, создавая отщепляемые слияния HIS-DSBC для белков-мишеней (см. рисунок 2).

Хотя основное внимание в протоколах здесь является автоматизация с использованием жидкой обработки робота и HTP электрофорез, эти методы также подходят для высокой пропускной ручного подхода, что означает, что даже лаборатории с базовой настройки могут воспользоваться протоколов без предварительного условия для дорогостоящего оборудования . Руководство протоколы для перехода к очистке и анализу (не относящиеся к дисульфидных богатой белками) были опубликованы ранее 24 и не будет здесь повторяться. Пропускная способность ручной процедуре (от выражения клона, производства рекомбинациинациональная клонирование 25, к анализу растворимых уровней белка) составляет 96 (с использованием системы распознавания SDS-PAGE) или 384 (4 х 96; использованием дот-блот и SDS-PAGE 26) культур в неделю (см. рисунок 1). Это может быть увеличена, если выполняется в полу-автоматическом режиме (с использованием жидкого обработки робота и дот-блот 26 или HTP электрофореза, например, с системой суппорт GXII LabChip 22 для анализа результатов) до до 1152 (12 х 96) культур параллельно более одной недели, как описано здесь. Культивирование проводят в глубокой скважины 24 формате (DW24), так что обычные Автоклавы могут быть использованы в отличие от культур, выращенных в глубокой скважины 96 формат (DW96), которые требуют использование коротких орбитальных высокоскоростной Автоклавы для достаточной аэрации (дрожание при 800 оборотах в минуту). Использование автоматического индукции СМИ 27 также упрощает выражение, избавляя от ручной шаг индукции. Даже там, где лаборатории уже используют предопределенные выражения и пуриусловия фикации, они могут быть переданы непосредственно в этом ПВТ системы просто для повышения эффективности. Подробная схема из высокопроизводительного скрининга трубопровода для дисульфидных богатых белками представлена ​​на рисунке 3. Были выбраны параметры в трубопроводе на основе обширных экспериментов скрининга 11, 22, что позволило нам выбрать наиболее полезные условия для производства белка.

Характеристика может быть выполнена на меченых белков, очищенных непосредственно из мелких выражений в экспериментальных исследованиях, где десятки микрограммов этого примера будет достаточно, или для чувствительных функциональных анализов и анализах связывания (например, низкий объем ПВТ патч зажим системы 28). То же самое может быть выполнено даже на непомеченных мишеней после расщепления, при условии, тэг и протеазы удаляют (например, ВЭЖХ с обращенной фазой). Контроль качества может быть также выполнена методом масс-спектрометрии (подтвердить ожидаемый размер и окисление улели) или методы хроматографии (для подтверждения чистоты или гетерогенность) 29. Иногда пометить расщепления не требуется или даже нежелательно (особенно для плохо растворимых белков 30,31), так что в этом протоколе расщепления не является обязательным. Несмотря на это, во всех конструкций есть протеазы сайт расщепления ТРВ (ENLYFQ / [G] 32) непосредственно предшествует ген-мишень для производства нативного белка после расщепления (см. рисунок 2 и обсуждение). Если расщепление слитого тега желании, расщепление может быть проверена (на элюции фракции или «на колонке ') в небольшом масштабе, чтобы проанализировать эффективность, оптимизировать условия в случае необходимости и получить надежные оценки дает для последующих масштабных вверх экспериментов.

Есть два варианта объема бисера, используемых во время аффинной очистки, в зависимости от целей и ожиданий эксперимента. Чтобы иметь возможность захватить как много белка, насколько это возможно (чтобы очистить пилот-анализов или МС, либо extrapolели для его увеличения урожайности) конечный объем 200 мкл смолы должны быть использованы, позволяя обнаружение растворимого белка в диапазоне 1-100 мг / л культуры до насыщения системы (см. протокол (А) в разделе 8.1) . Однако, если Целью эксперимента является обнаружение малых количеств растворимых белков затем конечный объем 50 мкл смолы подходит, позволяя обнаружение растворимого белка в диапазоне 0,1-25 мг / л культуры (см. протокол (B ) в разделе 8.2).

Производство можно масштабировать до, если требуется, чтобы получить миллиграмм количеств очищенного целей дальнейших структурных и функциональных исследований с использованием условий, указанных для растворимого выражения. Детали протоколов МАСШТАБА используемых в AFMB были обсуждены в другом месте 22,24.

Более подробная информация, имеющие отношение к экспериментальной установки, важных шагов в рамках протокола, модификации и устранение неисправностей и ограничения метода предоставляются на дискеussion. Пожалуйста, прочитайте обсуждение перед началом экспериментов.

В течение протоколов мы ожидаем показатель успеха 90% на каждом этапе (например, по крайней мере, 90% культур должны расти в любой данный шаг). Если скорость успех любого шага в эксперименте падает ниже 90% образцы отбрасываются, и эксперимент повторяется для полной коллекции конструктов. Тем не менее, этот показатель является не относится к числу конструкций, которые выражают в виде растворимых белков или доли конструкций, которые расщепляют с КПД 100%, так как это будет сильно зависит от белков испытания.

Конкретные данные настройки робота рабочего стола предусмотрены для каждого протокола (также см. рисунок 4), однако они могут быть адаптированы в соответствии с требованиями для альтернативных рабочий стол наборах. Робот метизы (Tecan) состоит из 96-многоканальный руки (MCA96), роботизированной манипулятора (Рома) и транспортировки жидкости с головы 8-канальный (Liha). Все шаги, использующие MCA96 также может быть выполнена с использованием Liha если MCA96 не доступна, однако они будут принимать дольше, потому что Liha будет нужно мыть между шагами. В то время как робот технически не является стерильной среде, включение антибиотиков обычно гарантирует, что Есть не проблемы с загрязнением или бесплодия.

Protocol

Часть А: Трансформация и испытаний Выражение Руководство процедуры клонирования 22 и перехода к очистке обсуждаются в других 24. Протокол преобразование может быть полностью выполнена на роботе 26, но это, как правило, более эффективный по времени, чтобы сделать это вручную. Поэтому протоколы здесь начинаются от прививки Предкультуры экспрессии и обшивки трансформации от теплового потрясла трансформации смешивает делается вручную. Более подробную информацию о ручных клонирования и трансформации процедур см. соответствующие ссылки 22,24. 1. Предкультуры и покрытия Подготовьте робота рабочий стол (см. рисунок 4 для позиций): Поместите 300 мл желоб, содержащий 150 мл стерильного бульона LB (с добавлением ампициллина (100 мкг / мл) / хлорамфеникол (34 мкг / мл) или другой соответствующий антибиотик) в положении 8. Положите стерильной DW96 в положении 11. Положите 4x предварительно подготовленный 24-а LB агар (Amp / CAM) чашки для тканевых культур (содержащих 2 мл агара в каждую лунку) с крышками на в позициях 14 до 17. Поставьте преобразования пластину (содержащий 96 преобразование смешивает после теплового шока) в положении 13. Эта информация будет использоваться для прививки жидкие Предкультуры и LB агаром. Положите коробку стерильных 200 мкл наконечники пипеток в положении 18. Использование 96-многоканальный рычаг (MCA96) и 200 подсказки мкл, аспирацию 200 мкл LB бульоне (положение 8) и обойтись в DW96 в положении 11. Повторите, пока не будет конечный объем 1 мл LB бульоне в каждую лунку DW96. Это станет жидкость предварительную культуру. Использование робота манипулятора (Рома), снимите крышку первой 24-и LB агаром и поместить его в другом месте (например, в носителя отеля), пока покрытие не будет закончена для этой пластинки. Использование жидкости 8-канальный обработки (Liha) голову, смешайте затем аспирата 50 мкл тон первый столбец смеси трансформации в положении 13. Такой объем смеси трансформации вполне достаточно, чтобы покрыть LB-агар хорошо. С первых 4-х каналов, обойтись на первом столбце первой 24-луночного LB агаром в положении 14 (как показано на рисунке 5). С последних 4-х каналов, обойтись на втором столбце первой 24-луночного LB агаром. Вымойте все советы тщательно после выдачи. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока все преобразования были высевали на первой пластине в положении 14, передача от 96 – до 24-а, используя схему, представленную в рисунке 5. После того, как первая пластинка была завершена, используйте Roma заменить крышку и снимите крышку со следующего пластины в положении 15. Продолжайте использовать схему гальванического течение следующих 3 пластин. После того, как покрытие будет завершена, установите Te-Shake до 1200 оборотов в минуту и ​​встряхните все тарелки в течение 1 мин, чтобы иметь равномерное распределение смеси трансформации. </lя> Использование MCA96 и оригинальные наконечники, смешать затем аспирата 60 мкл оставшейся смеси преобразования (положение 13) и обойтись в DW96, содержащей LB бульон в положении 11. Уплотнение Предкультуры DW96 с дышащей клейкой пленкой, чтобы позволить культуры аэрации. Место в 37 ° С дрожащей инкубаторе при максимальной скорости O / N (200/800 оборотов в минуту в зависимости от шейкере орбитального). Чашки с агаром LB должны быть помещены в капюшоне с их крышками от до сухого (10 мин). Тогда они не будут помещены перевернутой в 37 ° C пластины инкубаторе до следующего утра. На следующий день, предварительную культуру высевают тестовый выражение в авто-индукционной среде и для подготовки запасов глицерина. Положите агаром в холодильнике, как назад. Если необходимо, начиная с чашек с агаром или запасов глицерина, выражение тест может быть повторно сделано путем инокуляции свежей LB предварительной культуры непосредственно. 2. Подготовка DW24 ZYP-5052 Плиты Примечание: Эта процедура занимает примерно 5 минут, чтобы завершить для каждого набора 4x DW24 пластин. Макияж 500 мл ZYP-5052 авто-индукционной среде для каждой повторности 96 культур (464 мл З.Ы. средних, 250 мкл 2 М MgSO 4, 10 мл 50x 5052, 25 мл 20x NPS, именно в таком порядке – рецепты для каждого компонента приведены в таблице 1), дополненной соответствующими антибиотиками. Подготовьте робота рабочий стол: Поместите две 300 мл желоба, каждый из которых содержит ~ 250 мл среды в положении 5 и 6. Поместите четыре стерильные DW24 пластины в положениях 14 до 17. Поместите 200 мкл подсказки в положении 18. Использование MCA96 и 200 мкл наконечники, аспирации 200 мкл ZYP-5052 от позиции 5 и разлить в первом DW24 пластины в положении 14. Для этого в общей сложности 5 раз (4 подсказки обойтись в одной скважины сразу на общую 4 мл). Повторите эти действия для оставшихся 3 х DW24 пластин в положениях от 15 до 17, Свитцин в ZYP-5052 в положении 6 в течение последних двух DW24 пластин. 3. Прививка и рост тестовое выражение культур ПРИМЕЧАНИЕ: Прививка занимает около 10 минут, чтобы завершить для каждого набора 4x DW24 пластин, и рост продолжается O / N. Подготовьте робота рабочий стол: Поставьте DW96 пластину, содержащую Предкультуры (от шага 1,15) в положении 11. Положите четыре DW24 пластины, содержащие ZYP-5052 среды (со стадии 2.3) в положениях 14 до 17. Использование Liha аспирацию 100 мкл предварительной культуры от позиции 11 для инокуляции культур тест экспрессии (1/40 разведение) с использованием схемы, представленную в рисунке 5. Мыть голову Liha тщательно в промывочной станции между каждой колонке Предкультуры 96-луночных. Уплотнение пластин DW24 с проницаемой пленки и инкубировать при 37 ° С при встряхивании (200/400 оборотов в минуту) в течение 4 часов. Это время фазы роста в течение которого glucosе из среды будет предпочтительно быть исчерпаны 27. Уменьшите температуру до 17 ° С. После 4 ч и истощения глюкозы, лактозы начнет метаболизируется, что приводит к индукции экспрессии, обеспечение оптимальных условий роста для BL21 (DE3) pLysS или Розеттском 2 (DE3) pLysS, в этой работе 22. Оставьте клетки выразить O / N. Используйте оставшиеся прекультуры сделать запасы глицерина. 4. Подготовка глицерина Акции ПРИМЕЧАНИЕ: акции Глицерин должны быть сделаны в трех экземплярах, чтобы быть сохранены в разных местах в случае неудачи с морозильной камерой. Подготовьте робота рабочий стол: Положите микротитрационных планшетов в положении 5 до 7 для размещения запасов глицерина. Поместите 300 мл желоб наполненный 50 мл 100% глицерина в положении 8. Поместите DW96, содержащий 800 мкл предварительной культуры (после шага 3.2) в каждую лунку в положении 11. Поместите 200 мкл подсказки в положении 18. Использование SLOж стремление и дозирования скорость, используйте MCA96 и 200 советов мкл добавить глицерин в DW96, содержащей Предкультуры. Аспирируйте 200 мкл глицерина (с позиции 8). Разлить 150 мкл (в положении 11), а затем паузу в течение 20 сек, чтобы позволить остальные глицерин, чтобы достичь нижней части наконечника. Внесите оставшиеся 50 мкл. Используя те же советы, смешать с культурой и глицерина в DW96 в положении 11, пока они не будут тщательно перемешаны. Конечная концентрация глицерина составляет 20%. Аспирируйте 140 мкл от DW96 и разлить в первом микротитрационный планшет в положении 5. Повторите шаг 4,3 для каждого оставшегося микротитровальной пластины (позиции 6 и 7). Уплотнение каждый планшет с пластиковой липкой лентой и хранить при температуре -80 ° С. Откажитесь от оставшегося культуры в DW96, обеззараживания с противомикробного агента перед утилизацией. 5. Оценивая рост культур <p cдевушка = "jove_content"> ПРИМЕЧАНИЕ: Это не правило, необходимо оценить окончательный темпы роста в качестве окончательного OD 600, как правило, одинаковы для большинства культур (около 12 в этих условиях), однако любые культуры, которые не растут должно быть отмечено. Возьмите 50 мкл каждой культуры (начиная с шага 3.4) и разлить в с плоским дном, ясный микротитровальной пластины, содержащей 150 мкл среды. Измерить OD 600, с учетом разбавления в 4 раза. Если есть, что не очень хорошо растут, обратите внимание, это для окончательного анализа. 6. Сбора клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает около 45 минут, чтобы закончить. Центрифуга пластины 4x DW24 (со стадии 3.4) при 3000 мкг в течение 10 мин, затем отбросить супернатант в контейнер для отходов, содержащей антимикробный агент. Нажмите тарелки, в обратном порядке, листу фильтровальной бумаги, чтобы удалить лишнюю среду. В то же время, готовят 100 мл лизисабуфер (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола рН 8 или другой предпочтительный буфер), содержащего лизоцим (конечная концентрация 0,25 мг / мл). Подготовьте робота рабочий стол: Положите буфер лизиса в 300 мл корыто в положении 5. Положите чистую DW96 в положении 11. Положите х DW24 пластины 4, содержащие ячейки гранул (со стадии 6.1) в позициях 14-17. Положите 200 советов мкл в положении 18. Использование MCA96 и 200 советов мкл, аспирации 125 мкл буфера для лизиса от позиции 5 и разлить в каждой DW24 пластины (позиции 14-17). Повторите. Примечание: 4 подсказки обойтись в одной скважины сразу на конечном объеме 1 мл в каждую лунку планшетов DW24. Встряхнуть тарелки в положениях 14-17, использующих TE-Shake (1000 оборотов в минуту) в течение 15 мин для ресуспендирования гранул. После того, как гранулы ресуспендировали, используйте первые 4 канала в Liha для аспирации 550 мкл из образцов с 1 по 4 (первая колонка первой DW24, в положении 14), то, используя лАСТ 4 канала аспирате Liha 550 мкл образцов от 5 до 8 (второй столбец первой DW24). Не включать в первой строке DW96 в положении 11. Повторите шаг 6.6, так что все клеточной суспензии передается в DW96. После каждый набор образцов мыть советы Liha в промывной станции. Повторите этапы 6,6 до 6,8 для каждого столбца в каждой пластине (DW24 позиции 15-17), использующей схему представленную на рисунке 5. Уплотнение с пластиковой пленкой. Для очистки в тот же день или краткосрочного замораживания, хранить при температуре -80 ° С в течение не менее 1 часа, в противном случае хранить при температуре -20 ° С. Часть B: Очистка и анализ 7. Лизиса клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает около 60 минут, чтобы закончить. Оттепель замороженных суспензий клеток (начиная с шага 6,10) на водяной бане (при комнатной температуре или 37 ° С) в течение примерно 15 мин и ресуспендируют в дрожащей инкубатор для А.Н.опо лни тельная 10 мин. Культуры должен стать вязким. Возьмите 500 мкл ДНКазы складе и смешайте его с 1 мл MgSO 4 складе. Вручную с 8-канальной пипетки или с роботом Liha, обойтись 15 мкл в каждую лунку DW96, с получением конечной концентрации 10 мкг / мл ДНКазы и 20 мМ MgSO 4. Повторно запечатать табличку с пластиковой лентой и встряхивают в течение еще 15 мин. В этот момент культуры не должны быть вязкой. Проверьте тщательно (визуальным осмотром), что все культуры больше не вязкая. Примечание: Это имеет решающее значение, если некоторые культуры еще вязкий (например, если ДНКазы был случайно забыли или не обойтись надлежащим образом в некоторых скважинах), фильтр будет забивать, создавая неровную давление на образцы и переполнения или общей засорение Плата фильтра может произойти во время очистки. Для образцов SDS-странице всей лизата клеток, аспирации 10 мкл лизата и обойтись в тарелку 96-а ПЦР, содержащей10 мкл 4х SDS-PAGE образца буфера и 20 мкл воды. Денатурировать в течение 3 мин при 95 ° С и не замерзнуть до анализа (Всего фракция). Если система электрофореза ПВТ доступна, образцы могут быть проанализированы на это вместо следуя рекомендованная производителем протокол для пробоподготовки. За дополнительной информацией касательно анализа образцов см. раздел 10. 8. Ni Affinity Очистка ПРИМЕЧАНИЕ: медленная скорость стремление должны использоваться для пипетки все суспензий смолы, как суспензии являются довольно толстый. За сушку смолы приведет к снижению связывающей способности. Для очистки указанные концентрации имидазола применимы к никелевой аффинной смолой. Если альтернативные ионы (например, кобальта) используются, то концентрация должна быть соответствующим образом скорректированы. – Ni аффинной очистки для обнаружения в интервале 1-100 мг / л (конечный объем смолы = 200 мкл) ПРИМЕЧАНИЕ: Тего процедура очистки занимает около 1,5 часов, чтобы закончить, это означает, что вплоть до 4 может быть выполнена в течение одного дня. Подготовьте робота рабочий стол: Поместите 300 мл желоба, содержащие связывающем буфере (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола рН 8), промывочный буфер (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 50 мМ имидазола рН 8) и элюирование буфером (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол рН 8) в позиции 6 до 8, соответственно. Оставьте пустой 300 мл желоб в положении 5 к суспензии смолы. В положении 9 и 10 держателей пут пластины. В положении 10 положить DW96 с SPE блока и фильтра / приемника пластины (20 мкм) на вершине. Поставьте DW96, содержащий лизата (от шага 7.3) в положении 14. На позиции 18 и 19 поставить 200 мкл широкие советы Диаметр цилиндра и 200 советов мкл, соответственно. Положите два запасных DW96 тарелки для мытья и элюирования в отеле. ПРИМЕЧАНИЕ: Они также могут быть предоставлены в качестве альтернативного сайта на рабочем столе, если отель недоступен. Подготовьте 105мл, уравновешенную 33% суспензии смолы (35 мл смола + 70 мл буфера для связывания). Добавить смолы подвеску к кормушке в положении 5 непосредственно перед началом процедуры. Использование MCA96 и 200 мкл широкие советы отверстие (Позиция 18), смешать смолы суспензии в положении 5 тщательно перед аспирационных и дозирования 200 мкл суспензии смолы в DW96, содержащей лизата в положении 14. Повторите дважды, чтобы 600 мкл суспензии смолы был добавлен в лизате, смешивание смолы суспензии перед каждым аспирации. Выполнение стадии смешивания 10 мин с помощью MCA96 в положении 14, чтобы позволить для связывания и для предотвращения смолы из гранулирования. Аспирируйте от позиции 14 и обойтись 800 мкл (в 200 мкл большим) на фильтровальной пластине в положении 9, смешивание перед каждым аспирации в противном случае смола будет сохранена в нижней части DW96. Поверните вакуум на в положении 10 в течение примерно 90 сек для фильтрации лизата через пластины вDW96 собирать проточные, заботясь, чтобы не высохнуть смолы. Поверните вакуум прочь. Повторите этапы 8.1.5 и 8.1.6, так что все Затем смолу в фильтрующей плите. Использование цыган рука переместить SPE блок проведения фильтра пластину с 10-го на 9, так что следующим шагом для мытья идет непосредственно к отходов и передать DW96, содержащий проточные в положении 10 на другой сайт (например, в отель несущей) до конца процедуры. С новым набором 200 кончиков мкл (в положении 19), промывают смолу (в положении 9) в общей сложности 800 мкл буфера для связывания (от положении 6), а также применять вакуум в положении 9, пока буфер не прошла через . Повторите еще раз. Используйте Roma руку, чтобы разместить свежий DW96 в положении 10, чтобы собрать 50 мМ имидазола мытье и переместите SPE блок и фильтр тарелку сверху (положение 10). Добавить 800 мкл промывочного буфера из положения 7 на позиции 10, повернитевакуум, пока буфер не прошла до конца. Переключите вакуумный офф. С ROMA, удалите SPE блок и фильтр пластину в положение 9 и DW96, содержащий образец для мытья в отель, и не держать его в сторону до конца процедуры. Вымойте смолы с еще 800 мкл промывочного буфера (от позиции 7 на позиции 9), применить вакуум, пока буфер не прошел до конца. Повторите еще раз. Используйте Roma разместить свежий DW96 в положении 10 и поместите SPE блок и фильтр тарелку сверху собрать вымывание. Добавить в общей сложности 500 мкл буфера для элюции (с позиции 8 на позицию 9) и инкубировать на месте в течение 3 мин. Включите вакууме, пока все буфер не пройдет. Дополнительно: Для особо экспрессии белков, второй элюирования может быть выполнена в свежем DW96, как на этапах 8.1.14 и 8.1.15. Возьмите образцы проточный, вымыть и элюирования / с для SDS-PAGE или ПВТ электрофореза. <lя> Для образцов SDS-странице проточных, обойтись 10 мкл в тарелку 96-а ПЦР, содержащей 10 мкл 4X SDS-PAGE образца буфера и 20 мкл воды. Для образцов SDS-странице стирки и вымывания / с обойтись 30 мкл в ПЦР планшеты, содержащие 10 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера. Денатурация в течение 3 мин при 95 ° С и не замораживать до анализа. Для образцов ПВТ электрофореза, следуйте инструкциям производителя. За дополнительной информацией касательно анализа образцов см. раздел 10. B – Ni аффинной очистки для обнаружения в интервале 0,1-25 мг / л (конечный объем = смола 50 мкл) Примечание: Эта процедура очистки занимает около 30 минут, чтобы закончить, это означает, что вплоть до 12 может быть выполнена за один день. Подготовьте робота рабочий стол: Поместите 300 мл желоба, содержащие связывающем буфере (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола рН 8), моющего буфера (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 50 мМ имидазола рН 8)и элюирование буфером (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол рН 8) в позиции 6 до 8, соответственно. Оставьте пустой 300 мл желоб в положении 5 к суспензии смолы. В положении 9 и 10 держателей пут пластины. В положении 10 положить DW96 с SPE блока и фильтра / приемника пластины (20 мкм) на вершине. Поставьте DW96, содержащий лизата (от шага 7.3) в положении 14. На позиции 18 и 19 поставить 200 мкл широкие советы Диаметр цилиндра и 200 советов мкл, соответственно. Положите запасной 96-а планшет для элюирования в отеле. ПРИМЕЧАНИЕ: Это также может быть передано в альтернативной площадке на рабочем столе, если отель недоступен. Подготовка 50 мл, уравновешенную 25% суспензии смолы (12,5 мл смола + 37,5 мл связывающего буфера). Добавить смолы подвеску к кормушке в положении 5 непосредственно перед началом процедуры. Использование MCA96 и 200 мкл широкие советы отверстие (Позиция 18), смешать смолы суспензии в положении 5 тщательно перед аспирационных и dispensing 200 мкл суспензии смолы в DW96, содержащей лизата в положении 14. Инкубируют при комнатной температуре при встряхивании при помощи TE-дрожание при 1400 оборотах в минуту в течение 10 мин, чтобы позволить связывания. Аспирируйте от позиции 14 и обойтись полный 1200 мкл (в 200 мкл большим), используя широкие подсказки отверстие (Позиция 18) на фильтровальной пластины в положении 10. Смешайте перед каждым аспирации в противном случае смола будет сохранена в нижней части DW96. Поверните вакуум на в положении 10 в течение примерно 30 сек для фильтрации лизата через пластину в DW96 собрать проточный, заботясь, чтобы не высохнуть смолы. Поверните вакуум прочь. Использование Roma руку, переместите SPE блок, удерживающий фильтр пластину с 10-го на 9, так что следующим шагом для мытья идет непосредственно к отходов и передать DW96, содержащий проточные в положении 10 на другой сайт (например, в отель несущей) до конца процедуры. С 200 μл советов (в положении 19), вымыть смолу (в положении 9) в общей сложности 800 мкл буфера для связывания (с позиции 6), и применять вакуум в положении 9, пока буфер не прошел до конца. Повторите. Используйте Roma руку, чтобы разместить свежий DW96 в положении 10, чтобы собрать 50 мМ имидазола мытье и переместите SPE блок и фильтр тарелку сверху (положение 10). Добавить 150 мкл промывочного буфера из положения 7 на позиции 10, поверните вакуум, пока буфер не прошел до конца. Переключите вакуумный офф. С ROMA удалить SPE блок и фильтр пластину в положение 9 и DW96, содержащий образец для мытья в отель, и не держать его в сторону до конца процедуры. Вымойте смолы с еще 800 мкл промывочного буфера (от позиции 7 на позиции 9), применить вакуум, пока буфер не прошел до конца. Повторите. Используйте Roma разместить планшет в положении 9 и поместите SPE блок и фильтр тарелку сверху собирать тыс.э элюирования. Добавить 190 мкл буфера для элюции (с позиции 8 на позицию 9) и инкубировать на месте в течение 3 мин. Применить вакуум, пока все буфера не пройдет. Возьмите образцы проточного, стирки и элюирования для SDS-PAGE или ПВТ электрофореза. Для образцов SDS-странице проточных, обойтись 10 мкл в тарелку 96-а ПЦР, содержащей 10 мкл 4X SDS-PAGE образца буфера и 20 мкл воды. Для образцов SDS-странице стирки и вымывания / с обойтись 30 мкл в ПЦР планшеты, содержащие 10 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера. Денатурация в течение 3 мин при 95 ° С и не замораживать до анализа. Для образцов ПВТ электрофореза, следуйте инструкциям производителя. За дополнительной информацией касательно анализа образцов см. раздел 10. 9. Тег Расщепление (необязательно) Добавить протеазы TEV (2 мг / мл) в элюированного белка (из стадии (8.1.15 и 8.1,16) или стадии 8.2.14) в соотношении 1/10 (об / об). Инкубируют при комнатной температуре (или температуре 4 ° С для термочувствительных белков) O / N при осторожном встряхивании. В конце расщепления обойтись 30 мкл в тарелку ПЦР, содержащей 10 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера или следовать инструкциям завода-изготовителя для образцов ПВТ электрофореза. Фильтр оставшееся расщепления смеси (с шагом 9,2) через 96-луночного фильтр 0,22 мкм пластины и собирать растворимый проточный в DW96 с применением вакуума. Это может быть сделано в одном из вакуумных сайтов (например, положении 10) на наливных робота, как для стадий элюции в разделах 8.1 и 8.2. Это удаляет любой белок, который осаждают во время расщепления. После фильтрации обойтись 30 мкл в тарелку ПЦР, содержащей 10 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера или подготовить в качестве образцов ПВТ электрофореза. Это позволяет сравнение белка перед расщеплением, смесь после расщепления и зольuble белок, оставшийся после расщепления и дает хорошие признаки ожидаемых результатов в последующих наращивании масштабов экспериментов. За дополнительной информацией касательно анализа образцов см. раздел 10. 10. Анализ результатов Определение конструкции, экспрессирующие растворимый белок путем анализа проб очистки на SDS-PAGE, дот-блота или системы HTP-электрофореза такие как суппорт LabChip. Анализ образцов элюирования сначала определить конструкций, производящих растворимый белок. В большинстве случаев анализируются только образцы элюции если растворимые конструкции идентифицируются, чтобы свести к минимуму время, затрачиваемое на анализ. Если белок не в элюирования, запустите мыть и проточные образцы, чтобы увидеть, если она была выражена и не связывать правильно к смоле. Для конструкций, где нет растворимый белок не могут быть обнаружены запустить целую клеточного лизата чтобы увидеть, если было высказано белка. Примечание: Одно ограничение в том, что если рrotein интерес нет выше уровни экспрессии фон, она не может быть можно увидеть белок и может привести к ложному негатива. Следует отметить, что это всегда возможно для белки придерживаться и осаждаются на аффинной смолы, и это может привести к ложному отрицательному или недооценка выхода с использованием рекомендованный протокол (редкий случай в этой работе). В том случае, белок выпадает в осадок при элюировании (белый осадок видна через несколько минут / часов после элюирования), рекомендуется, чтобы изменить состав буфера (например, концентрация соли) и / или выполнить дифференциальной сканирующей флуориметрии анализа для оптимизации буферы. Небольшой образец смолы также могут быть повторно суспендируют в SDS-PAGE образца буфера и кипятят обнаружить, если белок удерживаться на смоле. Если белок не было выражено, но клетки действительно росло, проводить новую стратегию выражение, или если OD 600 не был достаточно высоким вырастить и повторный анализ культуру. </li> Если образцы расщепления должны быть проанализированы, они должны быть проанализированы в бок-о-бок образом, так что каждая конструкция может быть показано до расщепления после расщепления в соседних полосах движения, для упрощения анализа. Если с использованием способа, который дает прямой количественной оценки концентрации элюирующего, количественная не должна быть выполнена для положительных образцов путем измерения оптической плотности при 280 нм (А280). Измерьте A280, принимая вымирание коэффициент белка во внимание и используя буфер элюирования как заготовки, чтобы обеспечить оценку выходу протеина с целью выявления самых высоких выражающие растворимые конструкции. Для самых надежных сравнению растворимых урожайности, рекомендуется нормализовать урожайность по плотности культуры (с использованием OD 600 измерение), который был взят в разделе 5. Если все культуры выросла примерно до той же плотности, нормализация не требуется. е "> 11. Контроль качества Образцы могут быть проанализированы непосредственно с элюированием или образец расщепления с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ / МС). Кроме того, опреснения первый (для удаления имидазола и любые буферные соли, которые могут присутствовать), используя ZipTip наконечники или методов жидкостной хроматографии, а затем проанализировать с помощью матрицы-активированная лазерная десорбция / ионизация время пролета (MALDI-TOF) или ионизации электрораспылением ( ESI) масс-спектрометрии. Мелкие функциональные исследования могут быть выполнены, чтобы проверить, если функция белка, как и ожидалось. Если более крупные суммы, необходимые для функции, расширение масштабов культуры могут быть сделаны и функция испытания от большего культуры раз размера и степени окисления были подтверждены в небольших масштабах.

Representative Results

Типичные результаты показаны на рисунке 6 для скрининга экспрессии 96 дисульфидных богатых белков из VENOMICS трубопровода. Белки расположены на все большее число дисульфидных связей, то большее число остатков. Высказывались Пептиды в цитоплазме с His-меткой и партнера по слиянию DsbC. При использовании рекомендуемых условий культивирования, OD 600 из 12 обычно достигается. Пептиды очищали с использованием протокола 8,2-B с конечного объема 50 мкл никеля аффинной смолой, так что максимум ~ 25 мг / л слитого белка могут быть обнаружены в этом эксперименте. Фиг.6А показывает результат электрофореза из системы суппорт LabChip (показывающий сплав перед расщеплением) и балльной системы на основе экстраполяции, чтобы получить в мг / л культуры слитого белка (в уровнях от 0,1 до 2 мг / л культуры, от 2 до 10 мг / л культуры, от 10 до 25 мг / л культуры и не т обнаружено.) Обратите внимание, что расщепляется DsbC тег обычно работает около 32 кДа, а не 27 кДа, как ожидалось. Точно так же слияния DSBC также запустить около 5 кДа более высокие, чем ожидалось. Для многих целей мы не только видим неповрежденную слияние (верхняя полоса), но и партнер слияния в одиночку (нижняя полоса). Для некоторых из этих целей оптимизации условий культивирования может улучшить соотношение интактной синтеза (верхняя полоса) по сравнению с одной только DsbC, позволяющей увеличение конечного выхода. Счет в матче основан только на уровне неповрежденной синтеза. Только 16 из 96 белки не могут быть обнаружены на уровне слияния. Это соответствует общему уровню успеха 83%. Из 80 белков, которые могут быть обнаружены, 45 из них были обнаружены на уровнях, превышающих 2 мг / л культуры (56%). В зависимости от цели и синтеза, дает белковые, как правило, в диапазоне 2-100 мг / л культуры (хотя в данном примере с использованием протокола B 8,2 максимум ~ 25 мг / л слитого белка может быть обнаружен). т "> Анализ успехом числа дисульфидных связей, присутствующих (как показано на рисунке 6, б) показывает разумный успех для всех чисел дисульфидных связей протестированных (от 1 до 7), с самым низким уровнем успеха быть 66% для мишеней, содержащих 6 дисульфид облигации. Анализ распределения успеха выражения на основе изоэлектрической точки и количество остатков (как показано на рисунке 6С) не содержится никаких особых тенденцию для техники, с обеих успешно выраженных целей и задач, которые не были обнаружены разбросанные по сюжету. Рисунок 6D показан пример результатов, полученных масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии (ESI-MS) для одной цели, до и после сокращения образца с DTT. Как правило, такие исчерпывающий масс-спектрометрический анализ не нужно будет выполняться (уменьшается образец не нужно будет проанализировать), однако для целей тщательного Demonstratioн мы показали оба результата. Целевая показана 5.7 кДа дисульфид богатых яд белка с 4 дисульфидных связей. Спектр слева показывает результаты для белка перед восстановлением с DTT, как это было после расщепления и обессоливания без дальнейшего вмешательства. Спектр на правой стороне показывает белка после восстановления с последующим DTT обессоливания, чтобы удалить любой избыток DTT. Ионы, соответствующие экспериментальным масс обозначены стрелками на спектр и назначение для каждого иона отображается зеленым цветом. Экспериментальные родительские массы, рассчитанные для этих ионов (для белка перед восстановлением (-DTT) и после восстановления (+ DTT)) приведены в таблице. Массы (5709,6 Da для образца до сокращения и 5717,6 Да для сокращенной пробы) демонстрируют Разница масс 8 Да. Разница масса 2 Da соответствует присутствии 1 окисленного дисульфидной связью, поэтому разница масса 8 Da указывает на присутствие 4 дисульфидных связей (как ожидалось) вневосстановленный образец. Рисунок 1. Схематическое изображение протокола скрининга выражение высокой пропускной способности. Используя этот протокол, 96 до 384 условий могут быть проверены на одного человека в течение одной недели с использованием ручных методов, или до 1152 условия с описанной полуавтоматическое оборудование. Плазмиды экспрессии строятся с использованием технологии клонирования рекомбинации, так что многочисленные цели могут быть субклонирован в одно время. После того, как растворимые условия экспрессии были выявлены и декольте осуществляется, при желании, белок может перейти к контролю качества, чтобы проверить окисление и чистоту, microassays и / или крупномасштабное производство. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = "500" /> Рисунок 2. Схематическое для универсального рекомбинационной клонирования и построить конструкцию. Из клонов входа целевых, несколько векторы экспрессии может быть субклонирован в одном эксперименте в высокой пропускной моды (до 6 х 96 клонов входа в неделю). Выразил белка кодирует ЕГО тег для никеля аффинной очистки. DsbC (отсутствует его периплазматической сигнальную последовательность для цитоплазматической экспрессии) партнер слияния используется для увеличения растворимости и / или складывания помощи и правильное окисление белка-мишени. Заметим, что последовательность кодирования цель должна содержать N-концевой ТРВ протеазы сайт (ENLYFQ), если тег расщепления лучшего. На вставке в верхнем левом углу показано получение клонов запись с помощью вектора донора и последовательности-мишени, которая может быть получена с помощью ПЦР или генного синтеза. Входные клоны могут быть также получены из коммерческих входа коллекции клонов. Несколько рекомбинационной системы клонирования доступны, однако мы используем систе шлюза TSм, как показано на схеме. Рисунок 3. Скрининг трубопровода Высокая пропускная для нескольких дисульфидных богатых целей. Цели первоначально выражается в ЕГО-DSBC слияний в цитоплазме BL21 (DE3) pLysS Е. палочка в 37/17 ° С с использованием авто-индукции среды (ZYP-5052). Очистку проводили на никелевой смолы с последующим обнаружением растворимых конструктов по HTP-электрофореза (или с дот-блот / SDS-PAGE). Если первый раунд отбора выражение неудачно, альтернативные условия культивирования судят. Если конструкции производят растворимые белки в достаточно высокими выходами, microassays и контроля качества может быть выполнена и, при необходимости, крупномасштабное производство может быть продолжена. Для целей, где растворимые доходность не являются достаточно высокими, скрининг выражение может продолжить альтернативной стратемодули и температуры затем партнеры друга слияния и периплазматической экспрессии. Дополнительные этапы обозначены пунктирными коробки. Рисунок 4. Установка робота Worktable для HTP платформы. Расположение нашей наливных робота рабочего стола показан, хотя альтернативные рабочие столы могут быть также использованы при условии, что эквивалентные сайтов, доступных. Установка состоит из мытья станции (WS) для (8-канальный подготовки жидкости головы (Liha)), двух несущих микропланшетов с 4 позиций друг (MP4, позиционирует 1-4 и 5-8), вакуумной станции с 2 позиции (Те-пылесосы, позиционирует 9 и 10), микропланшет носитель с 3 позиций (MP3, позиционирует 11-13), два Шейкеры с 2 позиций друг (Те-Шейкеры, позиционирует 14-15 и 16-17) и носитель для одноразовыми наконечниками с 3-х положениях (Diti, позиционирует 18-20). Кроме тогоповторно два носители в отеле глубокие тарелки также и один для планшетов (не показано). Аппаратное обеспечение, установленное на жидком обслуживание робота является 96-многоканальный рука (MCA96) для использования с одноразовыми наконечниками, с подготовки жидкости голову 8-канальный (Liha) с фиксированными советы и роботизированной манипулятора (Рома), который движется Тарелки / оборудование вокруг на рабочий стол. Нумерация позиций упоминается на протяжении всего протокола. Рисунок 5. Схема для передачи из одного 96-луночного планшета на четыре 24-луночных планшетах. Рисунок 6. Типичные результаты показаны на экране экспрессии 96 дисульфидной богатых яда пробелки. были высказаны Белки, как его-DSBC слияний в цитоплазме и очищали с использованием 50 мкл никель смолы (протокол 8.2-б).) выражений скрининга результаты A, показывающие виртуальную гель и забил гол, выход экспрессии. Контраст в виртуальном геля была скорректирована пер-к-лейн, чтобы компенсировать очень слабых или интенсивных полос. Следует отметить, что для некоторых целей две полосы можно видеть, Верхний слой, соответствующий интактного слитого белка и нижней полосы, соответствующие слитого тега в покое. B) доля белков, экспрессированных на каждом уровне экспрессии по сравнению с количеством дисульфидных связей в белок. Фактическое количество белков в каждой группе накладывается на графике. C) Распределение уровней экспрессии на основе изоэлектрической точки (PI) и числа остатков. D) Пример массовой результатов спектрометрии для 5,7 кДа дисульфида богатых яда белок с 4 дисульфидными связями. Спектр налевая сторона показывает белок перед восстановлением с DTT и спектра на правой стороне показывает снижение белка с DTT, а затем обессоленной. Ионы, соответствующие экспериментальным масс обозначены стрелками и их назначения приведены в зеленый. Экспериментальные массы для белка до восстановления и после снижения показаны в таблице и демонстрируют разницу массовое 8 Да, что соответствует присутствии окисленного белка, после чего добавляли восстановитель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры . Компонент Рецепт Комментарий З.Ы. ~ 928 мл 10 г триптон 5 г дрожжевого экстракта 925 мл воды Смешайте а затем автоклав для стерилизации. </TR> 2 М MgSO 4 100 мл 49,3 г MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 мл воды Перемешать до полного растворения затем автоклав для стерилизации. 50x 5052 1 л 250 г глицерина 730 мл воды 25 г глюкозы 100 г α-лактозы Добавить в последовательности, размешать над огне, пока все растворяется затем автоклав для стерилизации. 20x NPS 1 л 900 мл воды 66 г (NH 4) 2 SO 4 136 г KH 2 PO 4 142 г Na 2 HPO 4 Добавить в последовательности и перемешать, пока все растворяется затем автоклав для стерилизации. Таблица 1. Рецепт для компонентов ZYP-5052 среде.

Discussion

Там нет ни одного универсальный протокол для выражения растворимых, складок функциональных белков. Чтобы быть экономически и эффективный по времени, большинство лабораторий или белковые основные средства, работающие с несколькими целями поэтому использовать высокую экспрессию пропускная белка скрининга, чтобы найти лучший 'общий' комбинацию переменных, чтобы получить растворимый активный белок для большинства целей. Мы определили DSBC как правило применимо партнер слияния для растворимого экспрессии богатого дисульфидных пептидов и белков 11. Использование DSBC слияния и методы высокой пропускной, в течение недели растворимый выражение нескольких целей можно наблюдать 11, а затем дополнительные переменные, такие как те, которые обсуждались во введении, может быть показан в последующих раундах на тех целей, которые требуют дальнейшей оптимизации. Протоколы, описанные здесь, направлены на экспрессию богатых дисульфидных белков и пептидов. Однако для пользователей, желающих ехрССГ не-сетчатые белков в высокой пропускной образом, соответствующие протоколы были опубликованы ранее и могут быть найдены в другом месте 22,24.

Высокая настройка пропускной идеально подходит для ряда приложений, в том числе демонстрацией большого количества различных белков для растворимого выражения или скрининга большого количества экспрессирующих конструкций (в том числе теги различных термоядерных) в течение нескольких генов-мишеней в то же время ( или несколько выражение конструирует для одной цели), чтобы улучшить показатели успеха. Платформа также может быть использован для сравнительного анализа и проверки новых протоколов на большом числе объектов. Другие области применения включают показ вариантов для одного сложной цели, например, все ортологи или членов одной семьи, или для проверки успех производства панели мутантов одной цели в одном эксперименте. Этот протокол был также использован в комбинации с со-экспрессирующих векторов (остротыч одного помеченного белок только), чтобы позволить тянуть вниз и Предварительное описание характеристик белок-белковых комплексов с последующей более тщательной биофизического анализа, чтобы подтвердить правильный образование комплекса и стехиометрии 33. Количество белка очищают иногда подходит для микро-анализа (функциональных тестов, белок-ДНК 34 или белок-белковых взаимодействий анализов). Есть несколько преимуществ для высокопроизводительного скрининга выражение стратегии: (я) в возможности тестирования большое количество задач или большое количество переменных в одном эксперименте, (II) с ограниченной вариации от партии к партии, (III) простота и удобство работы в меньшем масштабе, используя глубокие колодцы, (IV) масштабируемость и воспроизводимость в большем масштабе, (V) потенциал для автоматизации, и (VI) простота отслеживания и обращению (нет маркировки отдельных трубок, меньше ошибки, внесенные при использовании формата пластины, чем с обработкой отдельных трубок в смешивания или обмена клонов).

<pкласс = "jove_content"> Хотя это и не обсуждается в разделе протокола, есть несколько важных соображений для подготовки эксперимента, которые будут кратко рассмотрены ниже. Для более подробного обсуждения, см. нашу предыдущую публикацию 24. Для максимальной эффективности, это выгодно, чтобы иметь надлежащую систему для высокой пропускной клонирования, чтобы упростить суб-клонирование большого числа целей. Для начального этапа проекта VENOMICS, мы используем универсальный шлюз системы 25 рекомбинации, что позволяет субклонирование в любом вектора назначения в темпе сотен клонов в неделю. Протоколы для шлюза рекомбинации клонирования можно найти на веб-сайте Invitrogen. Другие альтернативы для высокой пропускной клонирования включают перевязки-независимое клонирование (ТИК) 35,36 и ограничение-Free (RF) клонирования 37. Есть несколько способов получить целевых генов для экспрессии, в том числе путем ПЦР из матричной ДНК, от входа коллекций клонов или каксинтетические гены, что является стратегия, выбранная для проекта VENOMICS. Синтетические гены могут быть заказаны с участками рекомбинации на каждом конце гена и гена синтеза позволяет легко оптимизация кодона последовательности гена-мишени (чтобы исключить редкие кодоны E.coli,). Это рекомендуется, но не существенно. Для целей без оптимизации кодонов, которые содержат большое количество редких кодонов, Розеттский 2 (DE3) pLysS (который несет тРНК редких кодонов, которые не высоко экспрессирован в E.coli) может лучше подходить чем BL21 (DE3) pLysS. Хотя есть штаммы доступны, которые ограничивают снижение дисульфидных связей в обычно восстановительной среде цитоплазмы, в наших руках они не были столь успешными, как очередной Е. штаммы палочки 11.

Аналитический масштаб аффинной очистки выполняется из культур тест экспрессии для восстановления растворимые белки слияния и количественно урожаи. Количественные данные могут быть получены на гое выходы растворимых слитых белков, выраженных в диапазоне 0,1 – 100 мг / л культуры. Если цель не растворяется, альтернативные выражения и индукционные температуры, напряжения или СМИ могут быть проверены перед различные партнеры слияния преследуются. Для растворимого выражения дисульфидных богатых белками, мы ранее ранг эффект партнеров слияния как DsbC> DsbA> НДС> MBP> TRX> His-меткой для цитоплазматической экспрессии 11. Периплазматической экспрессии и другая возможность, которая может помочь успешному складывание дисульфидных богатых целей. Периплазме является менее восстановительная среда, чем цитоплазме и содержит полезные окислительно-восстановительные сопровождающих, чтобы помочь дисульфидное связывание. DSBC, DsbA, и МВР белки, как правило, локализованы в периплазму их периплазматических сигнальных последовательностей. Это обеспечивает возможность эксплуатировать эти теги направить дисульфидных богатых цели в периплазматическом пространстве в целях оказания помощи складывания. Для неразрешимых задач, следующий шаг будет заключаться в рurify нерастворимого HIS-тегами цель из телец включения, растворения и сложите (это выходит за рамки этого протокола и не будут обсуждаться здесь 3 9). Это может быть достаточно простой для целей только с одним или двумя дисульфидными связями, но становится все более трудным, как количество дисульфидных связей увеличивается. С другой стороны, и особенно для белков и пептидов с четырьмя и более дисульфидных связей, это может быть полезно, чтобы попытаться более сложных производственных систем, таких как дрожжи, насекомых или экспрессии млекопитающих.

С достижениями в области миниатюризации и автоматизации, ПВТ электрофизиологии лаборатория-на-чипе технологии 28, несомненно, будет путь в будущее для функционального анализа. Мы предполагаем, что в большинстве случаев (возможно за исключением структурных исследований) это будет отрицать необходимость крупномасштабных культур. Масштабные культуры Малые будет не только полезным для скрининга условия экспрессии, но и быть в состоянии обеспечить достафициента составляет образца для этих миниатюрных функциональных анализов. Способность производить несколько целей параллельно в достаточных количествах для функционального характеристики снизит затраты на культивирование и использование такого рода платформ, экспрессия и характеристика рекомбинантных белков станет более экономически и время эффективным.

Протоколы здесь были применены к выражению дисульфидных богатых пептидов и белков в начальной фазе проекта FP7 Европейской VENOMICS. Ядов являются отличным источником биологически активных пептидов, которые часто обладают интересными фармакологическими потенциал. Тем не менее, их производство является сложной задачей из-за их сложных дисульфид-связывающих моделей и небольшого размера. Использование высокой пропускной платформы, как описанный здесь, проект направлен VENOMICS для создания библиотеки из 10000 новых пептидов яда, чтобы воспроизвести разнообразие наблюдается в природе. Эта библиотека будет эксплуатироваться для характеристики дисульфида-рич пептиды с потенциальной фармакологической или терапевтического применения с целью разработки новых лекарств. Платформа в настоящее время используется для тестирования и проверки новых протоколов для использования в проекте VENOMICS.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в рамках проекта VENOMICS, Европейский Проект по гранту N ° 278346 через Седьмой рамочной программы (FP7 ЗДОРОВЬЯ 2011-2015). Проект VENOMICS является результатом сотрудничества между несколькими научно-исследовательскими институтами и компаниями в Европе:

AFMB, Экс-Марсель Университет (Франция), CEA Сакле (Франция), NZYTech (Португалия), SistemasGenomicos (Испания), Университет де Льеж (Бельгия), VenomeTech (Франция), Vitamib (Франция), Зеландия Pharma (Дания)

Эта работа была поддержана французским объектов инфраструктуры для комплексного структурной биологии (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01.

Авторы также хотели бы поблагодарить г-на Джереми Turchetto за помощь в подготовке к съемке видео.

Materials

Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 °C. Use a 1 in 1000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One  780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator 
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570
http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity  Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600nm of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4
http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 .
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R., Chen, Y. W. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. 1091, 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. . Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1′ specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Tags

High ThroughputQuantitative Expression ScreeningRecombinant Disulfide-rich Venom ProteinsE. ColiStructural GenomicsDsbCDisulfide Bond FormationProtein ProductionTherapeutic Drug LeadsVenom ProteinsMass SpectrometryMicro-assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image