에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em> E. 대장균</em

파트 A : 변환 및 테스트 식 복제 (22)와 정화에 변환을위한 수동 절차는 다른 (24)에 대해 설명합니다. 변환 프로토콜은 완전히 로봇 (26)에서 수행 할 수 있지만, 일반적으로 더 효율적인 수동으로 할 수 있습니다. 따라서 프로토콜이 여기에 믹스가 수동으로 열 충격 변형에서 표현 precultures와 변환의 도금의 접종부터 시작합니다. 수동 복제 및 변환 절차에 대한 자세한 내용은 해당 참조 (22, 24)을 참조하십시오. 1. Precultures 및 도금 : 로봇의 작업 테이블 (위치에 대한 그림 4 참조)를 준비 150 ㎖의 멸균 LB 브로스 함유 된 300 ㎖ 넣어 트로프 (암피실린 (100 ㎍ / ml)로 보충을 / 클로람페니콜 (34 ㎍ / ㎖), 또는 다른 적절한 항생제) 위치에서 8. 멸균 DW에게 넣어위치 11에서 96. 위치 14-17에서 그들의 뚜껑 배 사전 준비 24 웰 LB 한천 (앰프 / CAM) 조직 배양 접시 (각 웰에 2 ㎖ 한천을 포함)을 넣습니다. 위치 (13)에서 (96 변환 heatshock 후 혼합 포함) 변환 플레이트를 넣습니다.이 액체 precultures와 LB 한천 플레이트를 접종하는 데 사용됩니다. 위치 (18)에서 멸균 200 μL 피펫 팁 상자를 넣습니다. 각 1 ㎖ LB의 국물의 최종 부피가 잘있을 때까지 96 – 멀티 암 (MCA96) 200 μL 팁, 대기음 LB의 국물 (위치 ​​8) 200 μl를 사용하여, 위치 (11)에 DW96로 분배. 반복 DW96. 이 액체 예비 배양 될 것이다. 로봇 매니퓰레이터 (로마)를 사용하여, 제 24 웰 LB 한천 플레이트의 뚜껑을 제거하고 도금이 그 판에 완료 될 때까지 (호텔 캐리어의 예를 들어) 다른 곳에 배치합니다. (LIHA) 머리를 처리하는 8 채널의 액체를 사용하여 T의 다음 대기음 50 μl를 혼합위치 13에서 변환 믹스의 그 첫 번째 열은. 변환 믹스의 볼륨이 잘 LB 한천을 커버하기에 충분하다. (도 5에 도시 된 바와 같이) 제 4 채널이, 위치 (14)에서 제 24 웰 LB 한천 플레이트의 첫번째 칼럼에 분배. 마지막으로 채널 4, 제 24 웰 LB 한천 플레이트의 제 칼럼에 분배. 철저하게 분배 한 후 모든 팁을 씻으십시오. 24 웰 그림 5에서 제공하는 방식을 사용하여 – 모든 변환이 96에서 전송, 위치 (14)에서 첫 번째 접시에 도금 할 때까지이 과정을 계속합니다. 제 1 판이 완료되면, 뚜껑을 교체하고 위치 15에서 다음 판에서 뚜껑을 제거하기 위해 로마를 사용합니다. 다음 3 판의 도금 방식을 사용하여 계속합니다. 도금이 완료되면, 1,200 rpm으로 테 동요를 설정하고 변환 혼합의 균일 한 분포를 가지고 1 분에 대한 모든 판을 흔들어. </lI> MCA96 원래 피펫 팁을 사용, 나머지 변환 혼합 (위치 ​​13)의 다음 대기음 60 μl를 혼합 및 위치 (11)에 LB 배양액을 포함하는 DW96로 분배. 문화 폭기 할 수 있도록 통기성 접착제 필름 DW96의 precultures를 밀봉. 최대 속도 O / N (800분의 200 rpm으로 진탕에 따라 다름)에서 ​​37 ° C에서 떨고 인큐베이터에있는 장소. LB 아가 플레이트가 건조 될 때까지 (10 분) 떨어져 그들의 뚜껑 후드에 배치되어야한다. 그리고 그들은 다음 아침까지 37 ° C 플레이트 배양기에서 반전 배치됩니다. 다음날, 예비 배양은 자동 유도 매체와 글리세롤 주식의 준비를위한 시험 식을 접종하는 데 사용됩니다. 백 업으로, 냉장고에 한천 플레이트를 넣습니다. 필요하면, 한천 플레이트 또는 글리세롤 재고품부터, 테스트 식 직접 신선한 LB의 전 배양액을 접종하여 다시 수행 될 수있다. DW24 ZYP 2. 준비-5052 판 참고 :이 절차는 4 배 DW24 플레이트의 각 세트에 대해 완료하는 데 약 5 분 소요됩니다. 각 구성 요소에 대한 조리법이있다 – 96 문화 (464 ㎖의 ZY 매체, 250 μL 2 M 망초, 10 ㎖를 50 배 (5052), 25 ㎖의 20 배의 NPS는 순서대로 각각의 복제에 대 한 500 ㎖의 ZYP-5052 자동 유도 매체를 구성하는 ) 표 1에 적합한 항생제로 보충. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 : 위치 5와 6시에 두 개의 300 ㎖의 골 ~ 250 ㎖의 매체를 포함하는 각을 넣어. 위치 14-17 4 개의 멸균 DW24 플레이트를 넣습니다. 위치 18에서 200 μL 팁을 넣습니다. MCA96를 사용하여 200 μL 팁, 대기음 200 위치 5에서 ZYP-5052의 μL 및 위치 (14)에서 첫 번째 DW24 판에 분배가.이 작업을 수행하면 5 배 (4 팁의 총 총 한 번에 하나의 우물에 분배합니다 4 ML의). 위치에 남아있는 3 개의 x DW24 판을 반복 15-17, SWIT지난 DW24 플레이트 위치 6에서 ZYP-5052에 칭. 테스트 식 문화의 3. 접종 및 성장 참고 : 예방 접종은 4 배 DW24 플레이트의 각 세트에 대해 완료하는 데 약 10 분 소요되며, 성장은 O / N. 계속 로봇의 작업 테이블을 준비한다 : 위치 (11)에서 (단계 1.15부터) precultures를 포함하는 DW96 플레이트를 넣습니다. 위치 14-17에서 (단계 2.3) ZYP-5052 매체를 포함하는 네 개의 DW24 플레이트를 넣습니다. 그림 5에서 제공하는 방식을 사용하여 테스트 식 문화 (40분의 1 희석)을 접종 LIHA 대기음 위치 (11)로부터 예비 배양 100 μl를 사용. 96 – 웰 precultures의 각 열 사이의 세척 역에 철저하게 LIHA 머리를 씻으십시오. 통기성 필름과 DW24 판을 밀봉하고 4 시간 동안 (400분의 200 분당 회전 수)을 흔들어으로 37 ° C에서 알을 품다. 이 중에 성장기의 시간이다 glucos매체에서 전자는 우선적으로 27 고갈 될 것입니다. 17 ° C로 온도를 감소 4 시간과 포도당의 고갈 후, 유당이 작품 22, BL21 (DE3) pLysS를 또는 로제 2 (DE3) pLysS를위한 최적의 성장 조건을 제공하는 식의 유도 선도 물질 대사로 변화되기 시작합니다. O / N.을 표현하는 세포 남기기 글리세롤 주식을 만들기 위해 나머지 예비 배양을 사용합니다. 글리세롤 주식의 4. 준비 참고 : 글리세롤 주식은 냉동실 실패의 경우에 서로 다른 위치에 저장하는 삼중으로해야한다. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 : 글리세롤 주식을 집에 7 위치 5에서 마이크로 플레이트를 넣습니다. 위치 8에서 100 % 글리세롤 50 ㎖로 채워 300 ㎖의 골을 넣습니다. 위치 (11)에서 각 웰에 (단계 3.2 이후) 예비 배양 800 μl를 포함하는 DW96를 넣습니다. 위치 18에서 200 μL 팁을 넣습니다. SLO를 사용하여W 흡입 및 토출 속도, precultures를 포함하는 DW96에 글리세롤을 추가 MCA96 200 ㎕의 팁을 사용합니다. 글리세롤의 대기음 200 μL (위치에서 8). (위치 (11)에서) 150 μl를 분배 제, 다음 나머지 글리세롤은 팁의 바닥에 도달 할 수 있도록 20 초 동안 정지. 나머지 50 μl를 분배. 그들은 완전히 혼합 될 때까지 같은 팁을 사용하여, 위치 (11)에 DW96의 문화와 글리세린을 섞는다. 글리세롤의 최종 농도는 20 %이다. 대기음 140 DW96에서 μL 및 위치 5에서 첫 번째 마이크로 플레이트에 분배. 나머지 각 마이크로 플레이트에 4.3 단계를 반복합니다 (위치 ​​6 및 7). -80 ° C에서 플라스틱 접착 테이프 및 저장소와 각 마이크로 플레이트를 밀봉 처분 전에 항균제로 오염을 제거, DW96에 남아있는 문화를 폐기하십시오. 5. 문화의 성장을 평가 <p c아가씨 = "jove_content"> 참고 : 최종 OD 600로 최종 성장률을 평가하는 것이 필요하지 않습니다, 그러나 성장하지 않는 문화가 주목해야한다 (이러한 조건에서 12 정도) 대부분의 문화권에 대해 일반적으로 동일합니다. (단계 3.4) 각 문화의 50 μl를 가지고 매체 150 μl를 포함하는 평면 바닥, 명확한 마이크로 플레이트에 분배. 계정에 4 배 희석을 고려하여 OD 600을 측정합니다. 잘 성장하지 않았다라도있을 경우, 최종 분석이주지. 6. 세포를 수확 참고 :이 절차는 완료하는 데 약 45 분 소요됩니다. 10 분 3,000 XG에서 (단계 3.4) 배 DW24 판을 원심 분리 한 후 항균제가 포함 된 폐기물 용기에 상층 액을 버린다. 초과 매체를 제거하는 플레이트, 거꾸로, 흡수를 용지에를 누릅니다. 한편, 용해를 100 ㎖를 준비완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸의 pH 8, 또는 다른 바람직한 완충액) 라이소자임 (최종 농도는 0.25 ㎎ / ㎖)을 함유. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 : 위치 5에서 300 ㎖의 저점에 용해 버퍼를 넣습니다. 위치 11에서 깨끗한 DW96를 넣습니다. 위치 14 ~ 17 년 (단계 6.1에서) 세포 펠렛을 포함하는 4 개의 x DW24 플레이트를 넣습니다. 위치 18에서 200 μL 팁을 넣습니다. MCA96 200 μL 팁, 대기음 위치 5에서 용해 버퍼 125 μl를 사용하고 (위치 ​​14-17) 각 DW24 판에 분배. 반복합니다. 참고 : 4 팁 DW24 플레이트의 각 웰에 1 ㎖의 최종 부피에 대해 한 번에 하나의 우물에 분배됩니다. 펠렛을 재현 탁하는 15 분 동안 테 흔들 (1,000 RPM)를 사용하여 위치 14-17에서 판을 흔들어. 펠릿을 재현 탁되면, 1 (위치 ​​(14)에서 제 DW24의 첫 번째 열 내지 4) 후, L을 사용하여 샘​​플에서 550 μl를 흡인하는 LIHA의 제 4 채널을 사용LIHA 대기음의 AST 4 채널 샘플 550 ㎕의 5 (첫 번째 DW24의 두 번째 열) 8. 위치 11에서 DW96의 첫 번째 행에 분배합니다. 세포 현탁액 전부는 DW96로 전송되도록, 단계 6.6를 반복한다. 각각의 샘플 세트는 세정제에 LIHA 팁을 세척 한 후. 반복 그림 5에서 제공하는 방식을 사용하여 각 DW24 플레이트의 각 열 (위치 15 ~ 17) 6.8 6.6 단계를 반복합니다. 플라스틱 필름으로 밀봉. 같은 날 또는 단기 동결, 1 시간의 최소 -80 ° C에서 저장소에 정제 달리 -20 ℃에서 보관 파트 B : 정제 및 분석 7. 세포 용해 참고 :이 절차를 완료하는 데 약 60 분 소요됩니다. 대한 떨고 인큐베이터에서 약 15 분,에 resuspend의 물 (RT에서 37 ° C) 목욕 (단계 6.10부터) 냉동 세포 현탁액을 해동10 분 dditional. 문화는 점성이 될 것이다. DNA 분해 효소 주식 500 μl를 타고 망초 주식 1 ㎖와 혼합. 수동으로 13 – 채널 피펫 또는 로봇 LIHA와 DNase를 10 μg / ㎖, 20 mM의 MgSO4로의 최종 농도를 제공하기 위해, DW96의 각 웰에 15 μl를 분배. 플라스틱 테이프로 판을 다시는 – 밀봉 추가 15 분 동안 흔들어. 이 시점에서 문화는 비 점성해야한다. 모든 문화가 더 이상 점성 것을 (육안 검사에 의해) 잘 확인하지 않습니다. 주 : 일부 문화가 샘플 및 오버 플로우 또는 총 막힘 고르지 압력을 생성, 여전히 (DNA 분해 효소가 실수로 일부 우물에 적절하게 분배 잊어되지 않은 경우, 예를 들면), 필터가 막히게됩니다 점성 경우에 중요하다 필터 판을 정화하는 동안 발생할 수 있습니다. 전체 세포 용 해물, 대기음 10 ㎕의 용 해물을 함유하고 96 – 웰 PCR 플레이트에 분주의 SDS-PAGE 샘플의4X SDS-PAGE 샘플 완충액 10 μL, 물 20 μL. 95 ° C에서 3 분간 변성 및 분석 (전체 부분)까지 동결. HTP 전기 영동 시스템을 사용할 수있는 경우, 샘플이 대신 샘플 준비에 대한 제조자의 권장 프로토콜에 따라 분석 될 수있다. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오. 8. 니켈 친화력 정화 참고 : 느린 흡입 속도가 모두 수지 현탁액을 피펫 팅을 위해 사용되어야한다, 현탁액은 아주 두꺼운으로. 이상 건조 수지는 바인딩 용량의 감소가 발생합니다. 정제를 위해, 특정 이미 다졸 농도는 니켈 친 화성 수지에 적용 가능하다. 대안 이온 (예를 들면, 코발트)가 사용되는 경우, 농도는 적절하게 조정되어야한다. – 1 ~ 100 ㎎ / L의 범위에서 검출 니켈 선호도 정화 (최종 수지의 부피 = 200 μL) 참고 : T자신의 정화 절차는 최대 4가 하루 만에 수행 할 수 있다는 것을 의미 완료하는 데 약 1.5 시간이 걸립니다. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 : 결합 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸의 pH 8), 세척 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 이미 다졸의 pH 8) 및 용출 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의를 함유하는 300 ml의 골을 넣고 위치에서의 NaCl, 250 mM의 이미 다졸의 pH 8) 6 ~ 8, 각각. 수지 슬러리 위치 5에서 빈 300 ml의 구유를 남겨주세요. 위치 9, 10 넣어 판 소지자. 위치 10에서 상단의 SPE 블록 및 필터 / 수신기 판 (20 μm의)와 DW96을 넣어. 위치 (14)에서 (단계 7.3) 해물을 포함하는 DW96를 넣습니다. 위치 (18, 19)에 각각 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 및 200 ㎕의 팁을 넣어. 호텔의 세척 및 용출 두 예비 DW96 플레이트를 넣습니다. 주 : 호텔 사용할 수없는 경우 그들은 또한 작업 테이블에 다른 사이트에 넣을 수 있습니다. 준비 105평형화 33 % 수지 슬러리 ㎖ (35 ㎖의 수지 + 결합 완충액 70 ㎖). 즉시 절차를 시작하기 전에 위치 5에서 저점에 수지 서스펜션을 추가합니다. MCA96 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 (위치 ​​18)를 사용하여, 철저하게 위치 14에 해물을 포함하는 DW96에 수지 슬러리 200 μl를 흡입 및 분배하기 전에 위치 5에서 수지 슬러리를 혼합. 두 번 반복되도록 수지 슬러리의 600 μL 각 흡인하기 전에 수지 현탁액을 혼합, 용해 액에 추가되었습니다. 결합을 허용하고 펠렛에서 수지를 방지하는 위치 (14)에서 MCA96을 이용한 10 분 혼합 단계를 수행한다. 대기음은 위치 (14)와 각각의 열망 전에 혼합, 위치 9시 필터 판에 (200 μL 많이있는) 800 μl를 분배에서 그렇지 않으면 수지는 DW96의 맨 아래에 유지됩니다. 으로 판을 통해 해물을 필터링하는 약 90 초 동안 위치 (10)에서의 진공을 켭니다DW96 수지를 건조하지 않도록주의하면서 흐름을 통해 수집합니다. 진공을 해제합니다. 수지의 모든 필터 플레이트에 다음 있도록 반복 8.1.5와 8.1.6 단계를 반복합니다. 로마 팔이 다음 세척 단계는 폐기물에 직접 들어가도록 9 위치를 위치 (10) 필터 접시를 들고 SPE 블록을 이동하고 호텔로, 다른 사이트 (예 :에 위치 (10)에 흐름을 통해이 포함 된 DW96를 전송하여 절차의 종료까지 캐리어). (위치 19에서) 200 μL 팁의 새로운 세트로, (위치 ​​6에서) 바인딩 버퍼 800 μL의 총 (9 번 위치) 수지를 씻어 버퍼가 통과 할 때까지 위치 9에서 진공을 적용 . 한 번 더 반복합니다. 50 mM의 이미 다졸 세척을 수집하고 (위치 ​​10) 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 이동 위치 (10)에 신선한 DW96을 배치 로마 팔을 사용합니다. 위치 (10)에 위치 7에서 세척 버퍼 800 μl를 추가, 설정버퍼가 통과 할 때까지의 진공. 진공 해제를 전환합니다. ROMA으로, SPE 블록 및 필터 플레이트 (9)를 배치하고 호텔로 세​​척 샘플을 포함하는 DW96를 제거하고 절차가 끝날 때까지 따로 보관. 버퍼가 통과 될 때까지 (위치 ​​(9)에 위치 7) 세척 버퍼의 또 다른 800 μL와 수지를 세척, 진공을 적용합니다. 한 번 더 반복합니다. 위치 10에 신선한 DW96을 배치하고 용출를 수집하는 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 배치 로마를 사용합니다. (위치 (9)에 위치 8) 용출 버퍼 500 μL의 총을 첨가하고 3 분 동안 현장에서 품어. 모든 버퍼가 통과 될 때까지 진공을 켭니다. 옵션은 : 높은 단백질을 표현하는, 제 용출 단계 8.1.14 및 8.1.15 같이 신선한 DW96로 수행 될 수있다. 의 샘플을 채취 흐름을 통해, SDS-PAGE 또는 HTP 전기에 대한 세척 및 용출 / s의. <l관류의 SDS-PAGE 샘플의 난>, 4X SDS-PAGE 샘플 완충액 10 μL, 물 20 ㎕를 함유하는 96 – 웰 PCR 플레이트에 10 μL 분주. 세척 및 용출의 SDS-PAGE 샘플의 / s의 4 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 10 μl를 포함하는 PCR 플레이트에 30 μl를 분배. 95 ° C에서 3 분간 변성 및 분석 할 때까지 동결. HTP 전기의 샘플은 제조 업체의 지침을 따르십시오. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오. B – 0.1 ~ 25 ㎎ / L의 범위에서 검출 니켈 선호도 정화 (최종 수지 양 = 50 μL) 참고 :이 정화 절차는 최대 12 하루에 수행 할 수 있다는 것을 의미 완료하는 데 약 30 분 소요됩니다. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 : (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸의 pH 8), (50 mM의 이미 다졸의 pH가 8을 300 mM의 염화나트륨을 50 mM 트리스)를 버퍼 흘려 결합 완충액을 함유하는 300 ㎖의 골을 넣고각각의 용출 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 NaCl을 250 mM의 이미 다졸의 pH 8) 위치에 6-8. 수지 슬러리 위치 5에서 빈 300 ml의 구유를 남겨주세요. 위치 9, 10 넣어 판 소지자. 위치 10에서 상단의 SPE 블록 및 필터 / 수신기 판 (20 μm의)와 DW96을 넣어. 위치 18에서. 위치 (14)에서 (단계 7.3) 해물을 포함하는 DW96를 넣고 19은 각각 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 및 200 ㎕의 팁을 넣어. 호텔의 용출에 대한 예비 96 – 웰 마이크로 플레이트를 넣습니다. 참고 :이 또한 호텔 사용할 수없는 경우는 작업 테이블에 다른 사이트에 넣을 수 있습니다. 평형을 25 % 수지 슬러리 (12.5 ㎖의 수지 + 37.5 ㎖를 결합 완충액) 50 ㎖를 준비합니다. 즉시 절차를 시작하기 전에 위치 5에서 저점에 수지 서스펜션을 추가합니다. MCA96 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 (위치 ​​18)를 사용하여, 철저하게 흡입 및 dispe 전에 위치 5에서 수지 슬러리를 혼합위치 (14)에 용 해물을 함유 DW96로 수지 슬러리의 200 μl를 nsing. 바인딩 할 수 있도록 10 분 동안 1,400 rpm에서 테 동요를 사용하여 진탕, 실온에서 품어. 대기음은 위치 (14)과 위치 (10)의 필터 플레이트에 넓은 구멍 팁 (위치 ​​18)를 사용하여 전체 1,200 μL (200 μL 많이있는)을 분배. 각 흡인하기 전에 혼합에서 그렇지 않으면 수지는 DW96의 맨 아래에 유지됩니다. 수집 DW96로 판을 통해 해물을 필터링하는 약 30 초 동안 위치 (10)에서의 진공을 돌려 흐름을 통해, 수지를 건조되지 않도록주의. 진공을 해제합니다. 로마 아암을 사용으로, 다음 세척 단계가 폐기물로 직접 이동되도록 구 위치 및 흐름을 통해 위치 (10)에서 다른 위치 (예 : 행을 포함 DW96를 전송하는 위치 (10)로부터 필터 플레이트를 들고 SPE 블록을 이동 호텔 캐리어) 절차의 종료까지. 200 μ와(위치 19에서) L 팁 (위치 ​​6) 바인딩 버퍼 800 μL의 총 (9 번 위치) 수지를 씻어 버퍼가 통과 할 때까지 위치 9에서 진공을 적용합니다. 반복합니다. 50 mM의 이미 다졸 세척을 수집하고 (위치 ​​10) 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 이동하는 위치 10에 신선한 DW96을 배치 로마 팔을 사용합니다. 위치 (10)에 위치 7에서 세척 버퍼 150 μl를 추가 버퍼가 통과 할 때까지의 진공을 켜십시오. 진공 해제를 전환합니다. ROMA 9의 위치를​​ SPE 블록 및 필터 플레이트를 제거하고 호텔로 세​​척 샘플을 포함하는 DW96, 그리고 절차가 끝날 때까지 따로 보관. 버퍼가 통과 될 때까지 (위치 ​​(9)에 위치 7) 세척 버퍼의 또 다른 800 μL와 수지를 세척, 진공을 적용합니다. 반복합니다. 위치 9에서 마이크로 플레이트를 배치 로마를 사용하여 일을 수집하는 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 배치전자 용출. (위치 (9)에 위치 8) 용출 버퍼 190 μl를 추가하고 3 분 동안 현장에서 품어. 모든 버퍼가 통과 될 때까지 진공을 적용합니다. SDS-PAGE 또는 HTP 전기의 흐름을 통해, 세척 및 용출의 샘플을 채취. 관류의 SDS-PAGE 샘플 들어 4X SDS-PAGE 샘플 완충액 10 μL, 물 20 ㎕를 함유하는 96 – 웰 PCR 플레이트에 10 μL 분주. 세척 및 용출의 SDS-PAGE 샘플의 / s의 4 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 10 μl를 포함하는 PCR 플레이트에 30 μl를 분배. 95 ° C에서 3 분간 변성 및 분석 할 때까지 동결. HTP 전기의 샘플은 제조 업체의 지침을 따르십시오. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오. 9. 태그 분열 (선택 사항) 단계 8.1.15 (8에서 용출 된 단백질 (에 TEV 단백질 분해 효소 (2 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.1 / 10의 비율 1.16) 또는 단계 8.2.14) (v / v). RT (또는 온도에 민감한 단백질 4 ° C) 부드러운 흔들림와 O / N을 품다. 분열의 끝에서 10 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 μL 또는 HTP 전기 샘플에 대한 제조업체의 지침에 따라 포함 된 PCR 플레이트에 30 μl를 분배. 96 – 웰 0.22 μm의 필터 플레이트를 통해 (단계 9.2에서) 나머지 절단 혼합물을 여과하고, 수집 가용 흐름을 통해 DW96에서 진공을 적용하여. 이 섹션 8.1 및 8.2에서 용출 단계 같이 액체 핸들링 로봇 진공 사이트 중 하나 (예를 들어, 위치 (10))에서 수행 될 수있다. 이 분열하는 동안 침전하는 단백질을 제거합니다. 여과 후, 4 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 10 μl를 포함하는 PCR 플레이트에 30 μl를 분배 또는 HTP 전기 샘플로 준비하고 있습니다. 이를 통해 절단 전의 단백질의 비교, 절단 및 졸 후, 혼합물uble 단백질은 절단 후 남은 이후의 스케일 업 실험에서 예상되는 결과의 좋은 표시를 제공합니다. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오. 결과의 10. 분석 SDS-PAGE 등 캘리퍼스 LabChip 같은 점 오점 또는 HTP 전기 시스템의 정화 샘플을 분석하여 수용성 단백질을 발현하는 구조를 확인합니다. 수용성 단백질을 생산하는 구조를 식별하기 위해 먼저 용출 샘플을 분석합니다. 수용성 구문이 확인되면 대부분의 경우에만 용출 샘플은 분석에 소요되는 시간을 최소화하기 위해 분석된다. 단백질 용출에없는 경우, 표현하고 수지에 제대로 결합되지 않은 경우에 세척 및 흐름을 통해 샘플을 볼 수 실행. 더 수용성 단백질은 단백질이 발현 있는지 확인하기 위해 실행 전체의 세포 용 해물을 감지 할 수 없습니다 구축합니다. 참고 : 여기에 한 가지 제한은 그 경우 P또한 rotein 위에서 배경 발현 수준을 제시되지 않고, 그 단백질을 보는 것이 가능하지 않을 수도 있으며 위음성으로 이어질 수있다. 그것은 단백질 스틱과 친 화성 수지에 침전이 거짓 부정 또는 과소 추정 권장 프로토콜 (이 작품의 드문 경우)를 사용하여 수율 이어질 수하는 것이 항상 가능하다는 것을 주목해야합니다. 단백질 (백색 펠릿 몇 분 / 시간 용출 후에 표시) 용출시 침전 경우 그것은 버퍼 조성물 (예를 들면, 식염 농도)를 변경 및 / 또는 최적화하기 위해 시차 주사 fluorimetry 분석을 수행하도록 권장 버퍼. 수지의 작은 샘플은 SDS-PAGE 샘플 완충액과 단백질이 수지 상에 유지되고 있는지 감지하는 비등 될 수있다. 단백질은 발현되지되었지만 OD 600 자라지과 문화를 다시 분석 충분되지 않은 경우 세포 성장의 새로운 표현 전략을 추구, 또는 않은 경우. </li> 절단 샘플을 분석 할 경우에 각각의 구문이 분석을 단순화하기 위해, 절단하기 전에 인접 차선에서 벽개 후에 도시 될 수 있도록, 그들은, 사이드 바이 사이드 방식으로 분석해야한다. 용출 농도의 직접적인 정량을주는 방법을 사용하지 않는 한, 정량화 280 NM (A280)에서의 흡광도를 측정하여 양성 샘플에 대해 수행되어야한다. 높은 발현 가용성 구조를 식별하기 위해 단백질 수율의 추정치를 제공하기 위해, 고려 단백질의 공동 효율적인 소멸 복용 안함로 용출 완충액을 사용하여, A280를 측정한다. 용해 수율의 가장 신뢰할 수있는 비교를 위해, 그것은 5 절에서 찍은 (OD 600 측정을 사용하여) 문화의 밀도에 의해 금리를 정상화하는 것이 좋습니다. 모든 문화는 거의 같은 밀도가 증가하는 경우, 정규화는 아니다 이 필요합니다. 전자 "> 11. 품질 관리 시료는 액체 크로마토 그래피 – 질량 분석기 (LC / MS)에 의한 용출이나 절단 샘플로부터 직접 분석 할 수있다. 또한, ZipTip 피펫 팁 또는 액체 크로마토 그래피 방법을 사용하여 (이미 다졸과 혹시있을 수있는 버퍼 염을 제거하는) 최초의 탈염, 다음 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 또는 전기 분무 이온화 (사용 분석 ESI) 질량 분석법. 소량 기능적 연구는 예상대로 단백질의 기능이 있는지 확인하기 위해 수행 될 수있다. 큰 금액이 기능을 위해 필요한 경우, 스케일 업 문화가 만들어 질 수 있고, 더 큰 문화 크기와 산화 상태에서 한 번 테스트 기능은 작은 규모에서 확인되었다.