で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em> E.大腸菌の</em

パートA：変換とテスト式クローニング22および精製への変換のためのマニュアルの手順は、他の場所で24議論されている。形質転換プロトコルは、完全にロボット26上で実行することができますが、手動でそれを行うには通常より時間が効率的です。そのためのプロトコルは、ここにミックスが手動で行う熱ショックを受け、変換からの発現前培養および変換のメッキの接種から始める。マニュアルのクローニングおよびトランスフォーメーション手続きの詳細については、関連する参考文献22,24を参照してください。 1。前培養及びめっき （位置については、図4を参照）ロボットワークテーブルを準備します。 150ミリリットルの無菌LB培地を含有する300ml入れトラフ（アンピシリン（100μg/ ml）を補充したに/クロラムフェニコール（34μg/ ml）を、適切な抗生物質または他の）位置8。 無菌DWを入れる11位の96。17位の14に彼らの蓋を（各ウェル中の2ミリリットル寒天を含む）4Xあらかじめ用意した24ウェルLB寒天（AMP / CAM）組織培養プレートを置く。 13位の（96変換がヒートショック後のミックスを含む）の変換プレートを置きます。これは、液体前培養し、LB寒天プレートに接種するために使用されます。 18位の無菌200μlのピペットチップの箱を置く。 の各ウェル内の1ミリリットルのLBブロスの最終容量があるまで、96のマルチチャンネルアーム（MCA96）と200μlのヒント、吸引LBブロス（ポジション8）を200μlを使用して、位置11でのDW96に分配することを繰り返しDW96。これは、液体前培養になります。 ロボットマニピュレータ（ローマ）を使用して、最初の24ウェルLB寒天プレートの蓋を取り外し、メッキが、その板に終了するまで（ホテルのキャリア中など）別の場所に置きます。 （LIHA）ヘッドを扱う8チャンネルの液体を使用して、吸引し、Tの50μLをミックス位置13での形質転換混合の彼の最初の列。形質転換混合のこのボリュームは十分にLB寒天をカバーするだけで十分です。 最初の4つのチャンネルを、（ 図5に示すように）14位の第24ウェルLB寒天プレートの最初の列に分注する。 最後の4チャンネルを、最初の24ウェルLB寒天プレートの2列目の上に分注する。 徹底的に分注後にすべてのヒントを洗う。 24ウェルに、図5に設けられたスキームを使用して-すべての変換は96から転送する、位置14で第一プレート上にプレーされるまで、このプロセスを続ける。 最初のプレートが完了したら、蓋を交換し、15位に次のプレートからふたを削除するためにローマを使用しています。次の3プレート用メッキ方式を使用して続行します。 めっきが完了すると、1,200 rpmまでのTe-シェイクを設定し、形質転換混合物の均一な分布を有するように1分間、すべてのプレートを振盪する。 </lI> MCA96と元のピペットチップを使用して、吸引し、残りの形質転換混合物（位置13）を60μlを混合し、11位でのLBブロスを含むDW96に分注する。 培養エアレーションを可能にするために、通気性接着フィルム付きDW96の前培養を封印。 最高速のO / N（シェーカー軌道に依存800​​分の200 rpm）で37℃の振盪培養器内の場所。 LB寒天プレートは、乾燥するまで（10分）から、その蓋つきのフード内に配置する必要があります。その後、彼らは次の朝まで37℃プレートインキュベーターで反転配置されます。 次の日、前培養は、自動誘導培地およびグリセロールストックを調製するためのテスト式に接種するために使用される。バックアップとして、冷蔵庫に寒天プレートを置く。必要に応じて、寒天プレートまたはグリセロールストックから出発して、テスト式を直接新鮮なLBの前培養物を接種することによって再度行うことができる。 DW24 ZYPの2。準備-5052プレート注：この手順では、4X DW24プレートのセットごとに完了するのに約5分かかります。 各コンポーネントのレシピがあります- 96の文化（464ミリリットルZY媒体、250μlの2Mの硫酸マグネシウム、10ミリリットルを50倍5052、25ミリリットルの20倍のNPSは、この順番でそれぞれの複製のための500ミリリットルZYP-5052自動誘導培地を構成する適切な抗生物質を補充した、 表1に）提供した。 ロボットワークテーブルを準備します。 5位と6位の2 300ミリリットルの谷、〜250ミリリットルの媒体を含む各を置く。位置14から17で4無菌DW24プレートを入れてください。18位の200μlのヒントを入れてください。 ZYP-5052200μlの位置5から、MCA96と200μlのヒントを吸引使用し、位置14において第DW24プレートに分注する。これを5回の合計でください（4ヒントは、合計一度に一つのウェルに分注するでしょう4ミリリットルの）。位置で残りの3×DW24プレートについて繰り返し15から17、SWIT最後の2 DW24プレート用の6位にZYP-5052にチン。 試験発現培養の3。接種および成長 NOTE：接種は4倍DW24プレートのセットごとに完了するのに約10分を要し、成長がO / Nを継続するロボットワークテーブルを準備します。 位置11に（ステップ1.15から）の前培養を含むDW96プレートを置く。位置14から17に（ステップ2.3から）ZYP-5052培地を含む4 DW24プレートを置く。 図5に設けられたスキームを使用してテスト式培養（1/40希釈）に接種するためにLIHA吸引位置11からの前培養液100μlを使用した。96ウェル前培養の各列間の洗浄ステーションで徹底的LIHAヘッドを洗浄します。 通気性フィルムとDW24プレートをシールし、4時間（400分の200 rpm）しながら37℃でインキュベートする。これは、増殖期の間の時間であるglucosメディアからの電子は、優先的に27を枯渇する。 17℃に温度を下げる4時間とグルコースの枯渇後に、ラクトースは、この作品22で、BL21（DE3）pLysSを、またはロゼッタ2（DE3）pLysSをするための最適な成長条件を提供し、発現の誘導につながる、代謝されると開始します。 O / Nを表現するために、細胞を残すグリセロールストックを作るために、残りの前培養を使用しています。 グリセロールストックの4。準備 NOTE：グリセロールストックを冷凍障害が発生した場合に、異なる場所に格納される三連でなされるべきである。 ロボットワークテーブルを準備します。 グリセロールストックを収容するために7に5位のマイクロタイタープレートを置く。 8位の100％グリセロールを50ミリリットルでいっぱい300ミリリットルトラフを置く。11位の各ウェルに（ステップ3.2の後に）前培養物800μLを含むDW96を入れてください。18位の200μlのヒントを入れてください。 SLOを使用したW吸引及び分配速度、前培養を含むDW96にグリセロールを追加しMCA96と200μlのヒントを参考にしてください。 グリセロールの吸引物200μL（位置から8）。 （11位の）150μLを分注最初に、残りのグリセリンは、先端の下部に到達することができるように20秒間一時停止する。残りの50μLを分注する。 彼らは完全に混合するまで、同じチップを使用して、11位のDW96文化とグリセリンを混ぜて。グリセロールの最終濃度は20％である。吸引液140 DW96からμLと5位の最初のマイクロタイタープレートに分注する。 残りの各マイクロタイタープレートのためのステップ4.3を繰り返し（位置6および7）。 -80℃で、プラスチック製の粘着テープや店舗、各マイクロタイタープレートをシール廃棄前に抗菌剤で除染、DW96の残りの文化を捨てる。 5。培養物の増殖を評価する<p c小娘= "jove_content">注意：これは、通常、最終OD 600は通常、ほとんどの文化（これらの条件で12前後）で同じであるように、最終的な成長率を評価することは必要ではなく、成長しないが、任意の培養は注目すべきである。 （ステップ3.4から）各培養液50μlを取り、培地150μLを含む平底、明確なマイクロタイタープレートに分注する。 考慮に4倍希釈を考慮して、OD 600を測定します。非常によく成長しなかったことをいずれかがある場合は、最終的な分析のためにこれを注意してください。 6。細胞を回収注：この手順を完了するのに約45分かかります。 10分間3000×gで（ステップ3.4から）4X DW24プレートを遠心分離し、抗菌剤を含有する廃棄物容器に上清を捨てる。余分な培地を除去するために吸収性の紙の上に、逆さま、プレートをタップします。 一方、溶解の100ミリリットルを用意リゾチーム（最終濃度0.25 mg / mlで）を含有する緩衝液（50mMトリス、300mMのNaCl、10mMのイミダゾールpH8で、または他の好適な緩衝液）。 ロボットワークテーブルを準備します。 5位の300ミリリットルトラフに溶解バッファーを入れた。11位のクリーンDW96を入れてください。位置14〜17（ステップ6.1からの）細胞ペレットを含む4×DW24プレートを置く。 18位の200μlのヒントを置く。 MCA96と200μlのヒント、吸引位置5からの溶解バッファー125μLを使用し、（位置14〜17）各DW24プレートに分注する。繰り返します。注：4のヒントはDW24プレートの各ウェル中の1ミリリットルの最終容量のために、一度に一つのウェルに分注するでしょう。 ペレットを再懸濁し、15分間のTe-シェイク（1,000 rpm）を使用して、位置14〜17でプレートを振る。 ペレットを再懸濁されたら、Lを使用して、（14番目の最初のDW24の最初の列、4）にサンプル1から550μLを吸引するLIHAの最初の4チャンネルを使用LIHA吸引のAST 4チャンネルのサンプルの550μlの5（第DW24の2列目）8。 11位のDW96の最初の行に分注する。 繰り返し手順6.6、細胞懸濁液の全てがDW96に転送されるようになっている。 試料の各セットの後に洗浄ステーションにLIHAのヒントを洗う。 繰り返しますが、 図5に設けられたスキームを使用して、各DW24プレートの各列（位置15〜17）のために6.8に6.6を繰り返します。プラスチックフィルムで封をします。 即日もしくは短期的な凍結、1時間で最低-80℃で保存、上の精製のためにそうでなければ、-20℃で保存するパートB：精製および分析 7。細胞溶解注：この手順が完了するまでに約60分かかります。 Aの振盪インキュベーター中で約15分間再懸濁するために（RT又は37℃）の水浴中（ステップ6.10）から凍結細胞懸濁液を解凍10分dditional。培養は、粘性になるはず。 DNA分解酵素原液を500μlを取り、 硫酸マグネシウム株式の1ミリリットルと混ぜる。手動で8チャンネルピ ​​ペットまたはロボットLIHAと、DNaseおよび20mMのMgSO 4を10μgの/ mlの最終濃度を与えるために、DW96の各ウェルに15μlずつ分注する。 ビニールテープでプレートを再密封し、さらに15分間振る。この時点で、培養は非粘性である必要があります。すべての文化はもはや粘性であること（目視検査による）を慎重に確認していません。注：いくつかの文化がサンプルとオーバーフローや総詰まりに不均一な圧力を発生させる、まだ（DNA分解酵素が誤っていくつかのウェルに適切に分配し忘れたり、されなかった場合など）は、フィルターが目詰まりします粘性であれば、これは非常に重要ですフィルタープレートは、精製中に発生する可能性があります。 全細胞溶解物のSDS-PAGEサンプルについて、溶解物を吸引し、10μlを含む96ウェルPCRプレートに分注する4×SDS-PAGE試料緩衝液10μlおよび水20μl。 95℃で3分間変性させ、分析（合計分）まで凍結する。 HTP電気泳動システムが利用可能である場合、サンプルは、サンプル調製のためのこの代わりに、次の部品メーカーの推奨プロトコル上で分析することができる。サンプルの分析に関する詳細はセクション10を参照してください。 8。ニッケルアフィ​​ニティー精製注：遅い吸引速度は全ての樹脂の懸濁液をピペッティングするために使用されるべきで、懸濁液はかなりの厚さであるように。過乾燥樹脂が結合能力の減少をもたらすであろう。精製のために、指定されたイミダゾール濃度は、ニッケルアフィ​​ニティー樹脂に適用可能である。別のイオン（ 例えば 、コバルト）を使用する場合、濃度に応じて調整されるべきである。 – 1-100 mg / Lの（最終的な樹脂容量=200μL）の範囲で検出するためのNiアフィニティ精製注：T彼の精製手順は、4までの一日で行うことができることを意味し、完了するのに約1.5時間を要する。 ロボットワークテーブルを準備します。 結合緩衝液（50mMトリス、300mMのNaCl、10mMのイミダゾールpH8）に、洗浄緩衝液（50mMトリス、300mMのNaCl、50mMのイミダゾールpH8）に、溶出緩衝液（50mM Tris、300mMのをを含有する300mlトラフを置く位置でのNaCl、250mMのイミダゾールpH8）に6〜8であった。 樹脂スラリーのために5位の空の300ミリリットルトラフのままにしておきます。 9位のおよび10は、プレートホルダーを置く。 10位の上に、SPEブロックとフィルター/レシーバープレート（20ミクロン）でDW96を置く。 位置14に（ステップ7.3）からの溶解物を含むDW96を入れてください。位置18および19には、それぞれ、200μlの広いボアのヒントと200μlのヒントを置く。ホテルでの洗浄や溶出のために2つの予備DW96プレートを置く。注：ホテルが利用できない場合、それらはまた、作業台に代替サイトに置くことができた。 準備105平衡化した33％の樹脂スラリー（35ミリリットル樹脂+結合緩衝液70ml）中の溶液。すぐに手続きを開始する前に、5位の谷に樹脂懸濁液を追加します。 MCA96と200μlの広いボアのヒント（位置18）を使用して、徹底的に位置14での溶解液を含むDW96に樹脂スラリーを200μlを吸引し、分配する前に、5位の樹脂スラリーを混合する。二回繰り返すことにより、樹脂スラリーの600μL各吸引する前に樹脂懸濁液を混合、溶解物に添加されています。 結合のために可能にし、ペレット化から樹脂を防ぐために、位置14でMCA96を用いて10分間混合工程を実行します。 位置14から吸引し、9位のフィルタープレート上に（200μLロット）800μLを分注するには、各吸引がそうで樹脂がDW96の一番下に保持される前に混合。 にプレートを通して溶解液をフィルター処理するのに約90秒の10位の上の真空をオンにし樹脂を乾燥しないように注意しながら、フロースルーを収集するDW96。真空の電源をオフにします。 樹脂のすべてがフィルタープレートにしてあるように繰り返して、8.1.5と8.1.6を繰り返します。 ROMAアームを使用すると、次の洗浄ステップは、廃棄物に直接移動するように9を配置し、フロースルー10位のホテルに別のサイト（ 例えば 、へを含むDW96を転送するために、位置10からフィルタープレートを保持するSPEのブロックを移動手続きが終了するまでキャリア）。 （19位の）200μlのヒントの新しいセットで、（位置6から）結合バッファー800μlの合計で（9位の）樹脂を洗浄し、バッファが通過するまでの位置9で真空を適用。もう一度繰り返します。 50 mMイミダゾール洗浄を収集し、（位置10）先頭へ戻る上のSPEブロックとフィルタープレートを移動させるために10位の新鮮DW96を配置するROMAアームを使用してください。 位置10に位置7からの洗浄緩衝液800μl加え、ターンバッファが通過するまでの真空。真空のスイッチをオフにします。 ROMAで、SPEブロックとフィルタープレート9を配置すると、ホテルに洗浄試料を含むDW96を削除し、手順の最後まで取って保管してください。 （ポジション9上に位置7からの）洗浄バッファーの別の800μlで樹脂を洗浄、バッファが通過するまで真空を適用する。もう一度繰り返します。 10位の新鮮DW96を配置し、溶出を収集するために、トップに戻って、SPEブロックとフィルタープレートを配置するためにローマを使用しています。 （ポジション9上に位置8から）の溶出緩衝液500μlの合計を追加し、3分間その場でインキュベートする。すべてのバッファが通過するまで真空をオンにします。 オプション：高度タンパク質を発現させるため、第二溶出がステップ8.1.14と8.1.15のように新鮮なDW96に行うことができます。 SDS-PAGEまたはHTP電気泳動用のフロースルーのサンプルを取り、洗浄、溶出/秒。 <lフロースルーのSDS-PAGEサンプルについてはi>は、4X SDS-PAGE試料緩衝液10μlおよび水20μlを含有する96ウェルPCRプレートに10μlずつ分注する。洗浄および溶出のSDS-PAGEサンプルについて/ sの4×SDS-PAGE試料緩衝液10μlを含有するPCRプレートに30μlずつ分注する。 95℃で3分間変性させ、分析まで凍結する。 HTP電気泳動サンプルについては、メーカーの指示に従ってください。サンプルの分析に関する詳細はセクション10を参照してください。 B – 0.1〜25 mg / Lの（最終的な樹脂容量=50μL）の範囲で検出するためのNiアフィニティ精製注：この精製手順は、12までの一日で行うことができることを意味し、完了するまでに約30分を要する。 ロボットワークテーブルを準備します。 結合緩衝液（50mMトリス、300mMのNaCl、10mMのイミダゾールpH8）に、洗浄緩衝液（50mMトリス、300mMのNaCl、50 mMイミダゾールpHを8）を含有する300mlトラフを置くそれぞれの位置6〜8、および溶出緩衝液（50mMトリス、300mMのNaCl、250mMイミダゾールpHを8）。 樹脂スラリーのために5位の空の300ミリリットルトラフのままにしておきます。 9位のおよび10は、プレートホルダーを置く。 10位の上に、SPEブロックとフィルター/レシーバープレート（20ミクロン）でDW96を置く。 位置14に（ステップ7.3）からの溶解物を含むDW96を入れてください。位置18および19には、それぞれ、200μlの広いボアのヒントと200μlのヒントを置く。ホテルの溶出のために予備の96ウェルマイクロタイタープレートを置く。注：ホテルが利用できない場合にも、作業台に代替サイトに置くことができた。 平衡化した25％の樹脂スラリー（12.5ミリリットル樹脂+結合緩衝液37.5ミリリットル）の50ミリリットルを用意します。すぐに手続きを開始する前に、5位の谷に樹脂懸濁液を追加します。 MCA96と200μlの広いボアのヒント（18位）、徹底的に吸引する前に、5位の樹脂スラリーを混合しの塗料を使用して位置14での溶解液を含むDW96に樹脂スラリーを200μlnsing。 結合を可能にする10分間1400 rpmでのTe-シェイクを使用して、振とうしながら、室温でインキュベートする。 位置14から吸引し、10位のフィルタープレート上にワイドボアのヒント（位置18）を使用して、完全な1200μL（200μLロット）を分注する。各吸引する前に混ぜるそうで樹脂がDW96の下部に保持されます。 樹脂を乾燥しないように注意しながら、フロースルーを収集するためにDW96にプレートを通して溶解液をフィルター処理するのに約30秒間10位の上の真空をオンにします。真空の電源をオフにします。 ROMAアームを使用して、次の洗浄ステップは、廃棄物に直接移動するように9を配置し、フロースルー10位の中に別のサイト（ 例えば 、へを含むDW96を転送するために、位置10からフィルタープレートを保持するSPEのブロックを移動ホテル事業）手続きが終了するまで。 200μで（19位の）Lチップ​​は、（位置6からの）結合バッファー800μlの合計で（9位の）樹脂を洗浄し、バッファが通過するまでの位置9で真空を適用します。繰り返します。 50 mMイミダゾール洗浄を収集し、（位置10）先頭へ戻る上のSPEブロックとフィルタープレートを移動させるために10位の新鮮DW96を配置するROMAアームを使用してください。 バッファが通過するまでに真空をオンに、位置10に位置7からの洗浄緩衝液150μLを加える。真空のスイッチをオフにします。 ROMAで9を配置するために、SPEブロックとフィルタープレートを取り外して、ホテルに洗浄試料を含むDW96は、手続きが終了するまで、横に置いておいてください。 （ポジション9上に位置7からの）洗浄バッファーの別の800μlで樹脂を洗浄、バッファが通過するまで真空を適用する。繰り返します。 9位のマイクロプレートを配置し、目を収集するために、トップに戻って、SPEブロックとフィルタープレートを配置するためにROMAを使用E溶出。 （ポジション9上に位置8から）溶出バッファー190μLを加え、3分間その場でインキュベートする。すべてのバッファが通過するまで真空を適用します。 SDS-PAGEまたはHTP電気泳動用のフロースルー、洗浄および溶出のサンプルを取る。 フロースルーのSDS-PAGEサンプルについて、4×SDS-PAGE試料緩衝液10μlおよび水20μlを含有する96ウェルPCRプレートに10μlずつ分注する。洗浄および溶出のSDS-PAGEサンプルについて/ sの4×SDS-PAGE試料緩衝液10μlを含有するPCRプレートに30μlずつ分注する。 95℃で3分間変性させ、分析まで凍結する。 HTP電気泳動サンプルについては、メーカーの指示に従ってください。サンプルの分析に関する詳細はセクション10を参照してください。 9。タグ切断（オプション） ステップ8.1.15（および8から（溶出されたタンパク質をTEVプロテアーゼ（2 mg / mlの）を追加します。1/10の比の1.16）または工程8.2.14）（v / v）である。 穏やかに振盪しながら、O / N（温度感受性タンパク質または4℃）、室温でインキュベートする。 切断の終了時に10 4×SDS-PAGEサンプル緩衝液又はHTP電気泳動サンプルに関するメーカーの指示に従っを含むPCRプレートに30μlずつ分注する。 96ウェルの0.22μmフィルタープレートを通して（ステップ9.2から）残りの切断混合物を濾過し、真空を適用することにより、可溶性のフロースルーDW96内を集める。これはセクション8.1と8.2での溶出工程のためのように、液体処理ロボットに真空サイトの一つ（ 例えば 、位置10）で行うことができます。これは、切断中に沈殿した任意のタンパク質を除去します。 濾過後、4×SDS-PAGE試料緩衝液10μlを含有するPCRプレートに30μlずつ分注するか、HTP電気泳動試料として調製。これは、切断前のタンパク質の比較を可能にする、切断後の混合物とゾルUBLEタンパク質が切断後に残っているとその後のスケールアップ実験で期待される結果の良い指標を提供します。サンプルの分析に関する詳細はセクション10を参照してください。 結果10。分析例えば、カリパーラボチップ（Caliper LabChip）等のSDS-PAGE、ドットブロット又はHTP電気泳動システム上での精製試料を分析することによって、可溶性タンパク質を発現する構築物を同定する。 可溶性タンパク質を生産する構成要素を識別するために、最初の溶出​​サンプルを分析します。可溶性構築物が同定されたほとんどの場合においてのみ、溶出サンプルを、分析に費やす時間を最小限にするために、分析される。 タンパク質が溶出されていない場合は、それが発現し、樹脂に適切に結合しなかったかどうかを確認するために洗浄し、フロースルーのサンプルを実行します。 全く可溶性タンパク質を検出することができないの構築物について、タンパク質を発現させたかどうかを確認するために、全細胞溶解物を実行します。 注：ここに1つの制限は、もしP関心対象のroteinは上記の背景発現レベルを提示していない、タンパク質を表示することができない場合があり、偽陰性をもたらし得る。これは、タンパク質が付着してアフィニティー樹脂に析出し、これが偽陰性または過小評価推奨プロトコル（この作品では珍しいイベント）を使用して、収量の可能性がありすることが常に可能であることに留意しなければならない。タンパク質は（白ペレットを数分/時間で溶出した後に表示されている）、溶出の際に沈殿する場合には、バッファ組成物（例えば、塩濃度）を変更および/または最適化するために、示差走査蛍光定量アッセイを実施することをお勧めしますバッファ。樹脂の小さいサンプルは、SDS-PAGEサンプル緩衝液に再懸濁し、タンパク質は、樹脂上に保持されているかどうかを検出するために煮沸することができる。 タンパク質が発現していなかったが、OD 600が再成長や文化を再分析は十分高いものではなかった場合には細胞は、成長する新しい式戦略を追求するか、しなかった場合。 </li> 劈開サンプルが分析される場合には、各構築物は、切断前にAN隣接レーンでの切断後に表示することができるように、それらは分析を簡単にするため、サイドバイサイドの方法で分析されるべきである。 溶出濃度の直接定量を与える方法を用いない限り、定量化は、280nm（A280）での吸光度を測定することにより、陽性試料について実行されるべきである。 最も高い発現可溶性構築物を同定するために、タンパク質収量の推定値を提供するために、アカウントへのタンパク質の共効率的消光を取り、ブランクとして溶出緩衝液を使用して、A280を測定する。 水溶性の利回りの最も信頼性の高い比較のために、それは第5で撮影した（OD 600測定を使用）文化の密度によって収量を正規化することをお勧めします。すべての文化がほぼ同じ密度に成長した場合、正規化はありません必要に。 E "> 11。品質管理試料は、液体クロマトグラフィー – 質量分析（LC / MS）により溶出または切断試料から直接分析することができる。 代替的に、をZipTipピペットチップまたは液体クロマトグラフィー法を用いて（イミダゾール及び存在し得る任意の緩衝塩を除去するために）最初に脱塩し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）又はエレクトロスプレーイオン化を（使用する分析ESI）質量分析法。 小スケール機能研究は、予想通り、タンパク質の機能があるかどうかを確認するために行うことができる。より多量の機能のために必要とされる場合には、スケールアップ培養を行うことができ、大きさや酸化状態一旦拡大培養物からテスト関数が小さなスケールで確認されている。