OBS: alla parametrar som anges i detta protokoll gäller för de instrument och modeller som anges här. Några av dessa parametrar (markerade med * i texten) kan skilja sig om en annan tillverkare eller modell används. 1. Uppstart av FIB / SEM Montera specialbyggd kall nanomanipulator (NM) spets utan att fästa Cu-flätor till anticontaminator (AC). Istället ser till flätor är anslutna till resten av NM ovanför isoleringspunkten för att förhindra laddning upp under skärpningssteget (1.2). Stäng SEM kammare, pumpar till högvakuum och bild på NM spetsen. Om spetsen är trubbig, böjda eller förorenade av tidigare användning, skärpa den med hjälp av jonstrålen: välj polygonala hålbilder längs sidorna av spetsen, så att efter fräsning, kommer spetsen avsmalnar nedåt till en um eller mindre. När sidorna hos spetsen har frästs bort, rotera genom 90 manuellt ° hela NM stångenutanför SEM kammare. Justera polygonal fräsmönster för att anpassa sig till den roterade spetsen och upprepa fräsning från en annan vinkel. När spetsen har skärpts för att vara mindre än 1 mikrometer, dra tillbaka NM och för in nålen i Gas Injection (GIS); flytta nålen att vara på ca 1 mm ovanför arbetsavstånd (i stället för de vanliga 175 nm). Om du använder en Pt gångare, ändra sin arbetstemperatur på 24-26 ° C (i stället för de vanliga 40 ° C). Dessa steg är nödvändiga för kryo-avsättning 13 av Pt. Öppna SEM kammaren och förbereda FIB / SEM för kryo-läge genom att montera Cryo provstadiet och AC. Växla NM till den insatta läge och anslut dess Cu-flätor till AC. Se till att inte oavsiktligt röra NM spetsen. Systemet kyls med NM in för att se till att förlusten av flexibilitet av Cu fläta vid låga temperaturer inte kommer att hämma NM flyttament. Purge rören för kylning med torr kvävgas under ett par minuter. Pumpa Cryo förberedelse kammaren och huvudprovkammaren till högvakuum. Lägg flytande kväve till Dewars svalna båda kamrarna. Vänta tills den önskade temperaturen är nådd. 2. Prov Frysning Montera två TEM galler för FIB prover på SEM överföringshållaren. Fäst dem genom att dra åt de motsvarande skruvarna med en skruvmejsel. Montera en prov stöta lämpligt för provet och tillsätt en del av provet. Beroende på vilken typ av prov, kan provet fixeras med kryogen lim eller med en klämma. Använda mängder så små som möjligt för att säkerställa optimal infrysning. Montera SEM överföringshållaren på vakuumöverföringsanordningen (VTD). Lägg flytande kväve i slamningsstationen och pumpa ner för att få kväve slask. Öppna slushing station och dopp-frysa SEM överföringshållaren. Pumpa ner igen tills kokning är klar och slask uppnås igen. Det bör noteras att en etan eller propån snöslask eller högtrycks frysning är bättre lämpade tekniker för att erhålla förglasning av provet. Dra tillbaka SEM överföringshållaren i vakuumkammaren i VTD och försegla den. Lufta slamningsstationen och Cryo förberedelse kammarluftsluss. Matcha VTD tätning med luftslussen för Cryo förberedelse kammaren och pump. När en god vakuumnivån uppnås, engagera luftslussen pin för att öppna sigill VTD och yttre luftslussen; sätt i SEM överföringshållaren. Det finns markeringar på glidkontakter i beredningskammare som anger provposition för sputtring och sprickbildning. Vid behov kan provet: bröt med den kalla kniven; sublimeras genom att ställa in en högre temperatur (vanligen -1006, C); belagd med Au / Pd eller Pt medelst kall sputterer (300 V, 10 mA, 60 sek efter en 2-3 nm Au / Pd cap) *. Sublimering bör inte användas för förglasat prov för att undvika deras omkristallisation. Använd den kalla kniven för att öppna de skyddande locken på TEM rutnät platser. Ta den kalla steget i provkammaren till mottagningshöjd (16 mm *). Stäng av HT på FIB / SEM och öppna det inre luftslussen. Använd VTD att överföra SEM hållaren i provkammaren. Ljusreglering belysningen i rummet kan hjälpa i det här steget. När SEM innehavaren i den kalla scenen, koppla ur VTD genom att trycka och vrida. Dra tillbaka VTD staven hela vägen in i VTD vakuumkammaren och stänga den inre luftslussen, det yttre luftslussen och VTD sigill. Den yttre luftslussen kan nu ventileras för att avlägsna VTD tätning. Det sista steget är inte nödvändigt, men det rekommenderas som VTD stången kan lätt rubbas av misstag, vilket kan orsaka skadortill VTD eller luftslussen. 3. Jonfräsning Slå på den höga spänningen på båda kolumnerna och ställ in lämplig bildparametrar (accelerationsspänning: 10 kV för elektronstrålen, 30 kV för jonstråle, spot storlek 3, arbetsavstånd: 5 mm, jonström: 10-100 pA för avbildning, 1-3 nA för fräsning) *. Använd elektronstråle för att hitta en funktion av intresse och för att få bilder för att dokumentera statusen för provet före extraktionen av lamellen. En gång har identifierat en region av intresse (ROI) för utvinning, markera den med jonstråle mönstring, om topografin av provet i sig möjliggör en enkel identifiering av ROI även efter Pt nedfall. För ökad precision, använd den metod som beskrivs av Pettersson et al. 14 Markeringarna ska vara djup, bred och tillräckligt långt för att vara fortfarande synliga efter att omfattas av Cryo-Pt deponering (som är icke-selektiva och kommer att omfatta flera mm 2 av provytan). Värm upp den prekursorn gas till 24-26 ° C och för in GIS nålen till en höjd av ca 1 mm ovanför provets yta (se även steg 1,3). Medan avbildning med elektronstråle, öppna gasventilen under några sekunder. Graden av kryo-Pt nedfall är 100-500 nm / sek eller mer, beroende på avståndet till GIS nål, prov strävhet och användarens system. Det är tillrådligt att köra några test nedfall att bestämma de optimala parametrar. Rå Cryo-Pt nedfallet är mycket grov och inhomogena. Bota depositionen över ROI med hjälp av en 1000 pA jonstråle vid låg förstoring (t.ex. 2.000 X). Till skillnad från Cryo nedfall, är denna härdning webbplats selektiv och bör utföras på endast ROI. Syftet med denna första kryo-nedfallet är att skydda ytan av provet från jonstrålar skador och minska curtaining under jon gallring 13. Vippa provet till52 °, så att ytan är vinkelrät mot jonstrålen. Mill bort två terrasse diken på vardera sidan av ROI. Typiska dimensioner för dikena är 20 till 30 um i den riktning (X) parallell med den lamell som skall extraheras, från 10 till 15 ^ m i den vinkelräta riktningen (Y) och med en variabel, sluttande djup (Z), med den djupaste punkten Nära till ROI. Lutningen bör vara 45-55 °. I vissa instrument kan terrasse diken endast malas med den djupaste punkten på toppen. I sådana fall, kvarn en under ROI, vrid sedan bilden 180 ° och kvarn den andra på den andra sidan. Djupet för fräsning kan väljas om sputter hastigheten för materialet är känd. För de flesta frysta hydratiserade provet kan sputter hastigheten is användas 7. Luta provet tillbaka till 0 ° och använda jonstråle att skära bort sidorna och undersidan av lamellen, och se till att skära märken gå igenom hela lameller (de bör lämna fräsmärken på terrasserade sluttningar kvarnened i föregående steg). Lämna bara två små broar som förbinder lamellen till resten av provet. Sätt i GIS nål (detta kan lätt flytta provet). Manöver NM tills dess spets är i fysisk kontakt med lamellen, helst på sidan. Se till NM inte hindrar jonstrålen tanke på de två små förbindningsbryggorna. Öppna GIS ventilen under ett par sekunder och övervaka kryo avsättning genom kontinuerlig avbildning med elektronstrålen. När ytterligare 1-2 um skikt av Pt har Cryo-deponerats, stänga ventilen. Cure Pt (se steg 2.6) endast i de få um runt den punkt där NM är i kontakt med lamellen. Använd en hög jonstråleström att klippa lamellen gratis. De två anslutningsbroar ska fräsas bort, liksom varje överskott av Pt som kan ha bildats nya kontaktpunkter mellan lamell och resten av provet. Inte dra GIS ålen ännu. </li> Försiktigt manövrera NM att extrahera lamell från dikena och flytta den åtminstone 500 um ovanför provets yta. Först efter att detta steg dras GIS nålen. Sänk provet scenen några mm och flytta den till dess en av de TEM gallren är i sikte. Flytta fästarea på gallret in i arbetsläge och för in GIS nålen. Försiktigt manövrera NM att bringa den bifogade lamell i fysisk kontakt med fästområdet på TEM-rutnät. Det bör inte finnas något tryck eller spänning mellan lamellen, TEM galler och NM. Öppna gasventilen för några sekunder och Cryo-insättning ytterligare 1-2 um skikt av Pt. Cure Pt (se steg 2.6) endast i de få um runt kontaktpunkten mellan lamellen och TEM-rutnät. Använd ett högt jonström att skära lamellerna fritt från NM. Detta kan åstadkommas genom att mala bort antingen NM spetsen eller den sida av provet. I than första fallet kommer spetsen måste slipas igen innan nästa användning, såsom beskrivs i steg 1,2. EXTRA: i detta skede är det möjligt att använda VTD att ta SEM överföringshållaren och förvara det O / N i en Dewar fylld med flytande kväve. Denna överföring och O / N lagring kan orsaka isbildning på ytan av lamellen om iskristaller redan finns och / eller om det flytande kvävet utsätts för fuktig luft; men sådana föroreningar kommer att tas bort av nästa steg i en relativt kort tid. Som de tidigare stegen kan ha tagit flera timmar att slutföra, kan det vara lämpligt att göra det, eftersom efter följande steg sådan lagring O / N rekommenderas inte, eftersom det inte skulle finnas något sätt att ta bort föroreningar isen utom genom sublimering (som kan inte utföras om förglasning av provet skall upprätthållas). Luta provet till 52 ° och använder jonstrålen till tunna det till elektron öppenhet 7. Det rekommenderas att börja med högre, Roughennes jonstrålen för att ta bort huvuddelen och fortsätt att bötfälla polera ytan med lägre jonstrålen, så småningom också minska accelerationsspänning. Den slutliga tjockleken på lamellerna skall vara från 100 till 200 nm eller mindre för ultrastruktur analys i ett 100-200 kV TEM eller upp till 500 nm för tomografi i en 300 kV TEM, beroende på provets sammansättning. Under gallring, kan de inre spänningarna i provet orsakar lamellen att krypa eller böja. I ett sådant fall bör den region förtunnad begränsas. Detta hände till exempel i figurerna 11 och 12. 4. Cryo Transfer till TEM Spola Cryo-överföringsstationen med torr kvävgas under ett par minuter. Lägg flytande kväve till Dewar av TEM AC och Cryo-överföringsstationen. Sätt i Cryo-överförings TEM hållare i den plats i kryo-överföringsstationen och fyller sin Dewar också. Vänta tills varje component har nått den önskade temperaturen (ca 15 min). Om möjligt, bör den registeransvarige av Cryo-överförings TEM hållare anslutas för att övervaka temperaturen under överföringen. Det är viktigt att inse att spetsen på TEM hållaren (där temperatursensorn är belägen) kommer att vara i kontakt med det kryo-överföringsstationen och därför kommer att kyla ner mycket snabbare än resten av TEM-hållaren. Det rekommenderas därför att den tid som behövs för hela kryo-transfer TEM hållare svalna mäts i förväg, och att systemet tillåts thermalize under åtminstone den tid. Fyll en kryogen kopp med flytande kväve och fördjupa sig i det: TEM provklämverktyg, en skruvmejsel och pincett, för att kyla ner sina tips till önskad temperatur. Alla verktyg ska vara väl isolerade på den andra änden för att inte förorsaka köldskador till operatörens hand. Passa VTD till den yttre luftsluss. Ta det kallt stage till överföringshöjden (16 mm *). Stäng av den höga spänningen. Öppna VTD sigill, den yttre luftslussen och den inre luftslussen. Använd VTD staven för att låsa in i SEM överföringshållaren genom att trycka och vrida medurs. Dra tillbaka SEM överföringshållaren i kryo förberedelse kammaren. Använd den kalla kniven för att stänga de skyddande locken på TEM galler. Detta är nödvändigt för att minska eventuella föroreningar is under överföringen. Använd VTD staven för att flytta provet i vakuumkammaren för VTD. Stäng luftslussar och sigill. Lufta den yttre luftslussen och ta loss VTD. Matcha VTD till SEM-porten på Cryo-överföringsstationen. Medan spolning med torr kvävgas, använd stiftet på stationen för att öppna sigill VTD och skjut SEM överföringshållaren i Dewar av Cryo-överföringsstationen. Lägg tillräckligt med flytande kväve så att nivån i Cryo-överföringsstationen är tillräckligt högatt bara doppa provet. Använd tidigare kyld skruvmejsel för att öppna ett av locken och lossa motsvarande skruven som håller TEM rutnät på plats. Använd de tidigare kylda pincett för att plocka TEM galler och placera den i TEM hållaren. Använd den kylda hexring att fästa TEM rutnät på TEM hållaren. Stäng slutaren av Cryo-överförings TEM hållare. Provet överförings steg är avgörande och kan hämmas av kvävgas att minska synligheten av den lilla TEM provet. Koppla bort Cryo-överföringsstation från pumpsystemet och transportera den i närheten av TEM, tillsammans med uppvarmningsstyrenheten av Cryo-överförings TEM hållare. Starta turbomolekyl pump av TEM för att pumpa det bärande linje till TEM luftsluss. Ställ TEM provstadiet till en lutning * på -70 °. Ställ kortast pumpningstiden för luftslussen (30-60 sek), med endast en cykel av spolning med torr kvävgas. </li> Se till att skyddskåpan över kryo-överförings TEM hållaren är avslutad. Ta TEM hållaren från kryo-överföringsstationen och sätt in den i lutande goniometer (flytande kväve läcker ut TEM hållaren Dewar). Den pumpcykel kommer att starta. När cykeln är klar, ställ in goniometer att luta tillbaka till 0 ° och, samtidigt, håll TEM hållaren så att den inte roterar med vinkelmätare. Sätt den helt inne i TEM. Under detta steg bör den kryo-överföring TEM hållaren vara ansluten till dess uppvärmningsstyrenheten för att övervaka temperaturen. Proceduren för att sätta in provhållaren i TEM kan variera mellan olika TEM. Det rekommenderas därför att kontakta TEM tillverkaren för att få relevanta förfarandet. Fyll på Cryo-överförings TEM hållare Dewar. Vänta på vakuumet i TEM för att nå en acceptabel nivå.