JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול"ג בזמן

Published: July 15, 2014
doi:
10.3791/51456
, ,
1Racah Institute of Physics,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Abstract

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Introduction

חיידקים התפתחו להגיב להרבה מצבים מלחיצים. תכונה כללית של הסתגלות ללחץ היא שינוי ב1,2 דינמיקת צמיחה. דינמיקת צמיחה מאופיינת בעיקר על ידי שני פרמטרים: קצב מעריכי צמיחה וזמן ההשהיה, כלומר את הזמן הדרוש כדי להסתגל לתנאים חדשים. בעוד מספר רב של שיטות תפוקה גבוהה להתמקד במדידות של קצב הצמיחה, זמן ההשהיה הוא לעתים קרובות פרמטר להתעלם, למרות שזה הפרמטר הקריטי לאפיון של ההסתגלות לתנאים חדשים. כימות של ההסתגלות לתנאים משתנים באופן מסורתי מתבצעת באמצעות שיטות ידניות מייגע 3,4. לאחרונה, טכניקות מתקדמות פותחו לצורך הניתוח של תאים בודדים 5,6. עם זאת, זה עדיין קשה להבחין צמיחה נורמלית לאחר עיכוב בצמיחה (כלומר זמן השהיה) 2,3 מצמיחה איטית. שיטה אוטומטית נבנתה, 7 ScanLag, כדילהפלות בין שני פנוטיפים דומים אלה.

דוגמא בולטת לחשיבותו של המחקר של התפלגות זמן ההשהיה מתגלה תחת טיפול אנטיביוטי. רבים באנטיביוטיקה ולחצים אחרים להרוג תאים רק הולך וגדל באופן פעיל, ולכן תאים שהם "מפגרים" מוגנים 8. כדי לפקח על זמן השהיה, ניתן לראות תאים בודדים תחת מיקרוסקופ ולפקח על זמן הליגה ראשונה. חסרון עיקרי של שיטה זו הוא שטווח הזמן הדינמי הוא מוגבל; אותם תאים שגדלים מוקדם לכסות את פני השטח בקצב מעריכי, בצורה יעילה ומקטין את הצמיחה של תאים עם זמן שהייה ארוך יותר. שימוש בזרימת תאים מעט עוקפת 5 הזה, אבל מספר מוגבל של תאים יכול להיות במעקב ואת החלק היחסי של חיידקים שיציאה משלב הפיגור אחרי רוב האוכלוסייה החלה גובר לא ניתן לצפות. למרות מגבלות אלה, מספר מחקרים העריכו את ההשפעה של הרמה different מדגיש על חלוקת זמן השהיה באמצעות מיקרוסקופ תא בודד 9-12. דרך נוספת כדי לפקח על חלוקת זמן השהיה היא באמצעות מדידות עכירות 13,14. תרבויות רבות במקביל, כל אחד התחילה מתא בודד, הם גדלו בקורא צפיפות אופטי המודד את מספר החיידקים בתרבית לאורך זמן. שיטה זו מוגבלת על ידי הדיוק של הניפוח ולמספר הבארות בצלחת.

שיטה אוטומטית שפתחה, בשם ScanLag, המאפשרת פעמים בפיגור והפצות זמן צמיחה להיות מוערכים, אפילו עבור אחוז הקטן של חיידקים באוכלוסייה שיש לי פעמים בפיגור רבות מאוד. השיטה מבוססת על זיהוי של מושבות על צלחות אגר מזין קונבנציונלי 15 (איור 1). כדי להפוך את זיהוי 16,17 מערך של סורקים מסחריים 18 שמופנים על ידי תוכנה בבית לרכוש מעת לעת תמונות של הצלחות, היה מהונדס. תוכנה הייתהנועד לנתח את התמונות באופן אוטומטי ולחלץ פרמטרים כמותיים 19,20, כגון זמן של ההופעה בכל פעם שמושבה והצמיחה של כל מושבה, אשר מוגדרת כאן כזמן לגדול מ20 פיקסלים 80 פיקסלים. כאן אנו מציגים את השיטה בפירוט, כולל ההתקנה של המערכת והשימוש בתוכנת ניתוח תמונה האוטומטית אשר שופרה עם ממשק משתמש טוב יותר.

שיטה זו יכולה להיות מותאמת למדידת מאפיינים אחרים של מושבות, כגון מורפולוגיה וצבע. מדידה של סוגים אלה של פרמטרים תאפשר השימוש של המערכת בPhenomics הרב ממדי. כשיטת מזהה מושבות של תאים בודדים, המערכת יכולה לחשוף פנוטיפים חדשים שלא ניתן למדוד על ידי מדידות ברמת אוכלוסייה. הטכניקה מאפשרת איתור ואחזור של גרסאות נדירות, ומאפשרת הקרנה של תכונות הרצויות.

Protocol

1. לבנות ההתקנה בחר סורק עם רזולוציה אופטית: 4,800 dpi; רזולוציה חומרה: 4,800 x 9,600 dpi; עומק צבע קצת: 48 ביט, שיכול לפעול ברמות טמפרטורה והלחות הרלוונטיות. יש צלחות פטרי בהיקף משמעותי, בניגוד לנייר משמש בדרך כלל על סורקים מסחריים. המושבות לשכב על גבי השכבה אגר, כ 5 מ"מ מעל פני השטח של הסורק. הערה: עבור רוב סורקי המושבות תהיה בפוקוס. חברות סורק מסוימות אינן מאפשרות חיבור של יותר ממופע אחד של סורק מאותו הסוג לאותו מחשב. ודא שסורק יותר מאחד יכול להיות מחובר ומזוהה באופן ייחודי. הכן את האביזרים כמפורט להלן: פיסות שחורות סטרילי להכין הרגישו בד כדי לכסות את הצלחות (איור 1 שלב 2). כדי להחזיק את צלחות פטרי במקום, להכין מחזיקי לבנים צלחת (חומרים ושיטות) שמתאימים סורקים ושיש להם 6 חולes בגודל של המנות (איור 1 שלב 3). במידת הצורך לצמיחה של מיקרואורגניזם, לשים את הסורקים בסביבה מבוקר טמפרטורה. חבר את הסורקים למחשב. אופציונאלי: חיבור הממסר למחשב ולעקוף את מתג הפעלה / כיבוי של הסורק כדי להתגבר על שיפוע טמפרטורה. הערה: יחידת הממסר למיקרואורגניזמים מאוד רגישה לטמפרטורה. זה מכבה את הסורק כך שהאלקטרוניקה לא לחמם את פני השטח בצורה לא אחידה. שימוש רק בחלק ממשטח הסורק יכול להשיג תוצאות דומות. 2. התקן את מנהל הסריקה העתק את כל קבצי היישום 'סריקת מנהל' לתוך ספרייה ייעודית מhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. קבע את תצורת קובץ ScanningManager.exe.config לפי שמות הסורקים כפי שהם מופיעים בניהול-> מנהל-> התקני הדמיה מכשיר למחשב ( <strong> איור 2). לפתרון בעיות של היישום 'מנהל סריקה', לראות את לקרוא לי קובץ. לתיעוד נוסף על היישום 'מנהל סריקה', ראה Documentation.html. 3. לבצע ניסוי הכן את צלחות פטרי (איור 1): לדלל את התרבות לכ -2,000 CFU / מיליליטר. פלייט 0.1 מיליליטר של התרבות אחידה על פני השטח הצלחת. כדי לקבל קונטרסט טוב בין המושבות והצלחת ולספוג לחות, מכסה את הצלחת עם חתיכה השחורה סטרילי הרגיש בד. שים את המכסה על הצלחת. מניחים את הצלחות במחזיקים בסורקים. הפעל את מנהל הסריקה (איור 3): בחר את הסורקים משתתפים מהרשימה של סורקים מצורפים. בחר את מספר התמונות שיש לנקוט (חזרות), מרווח הזמן בין התמונות הבאות (פער זמן), ועיכוב הזמן לפני שמתחיל tהוא להתנסות (התחל אחרי). 4. ניתוח של תמונות הערה: קווי המתאר של שיטות חישוביות מסופקים לניתוח התמונות בMATLAB באמצעות "ScanLag", שהוא זמין באופן חופשי לשימוש לא מסחרי בhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. פונקציות נוספות זמינות מפורטות בתוכנה ידנית, וקוד דוגמא הוא בתוספת. מיין את התמונות מסורק בתיקיות נפרדות. באמצעות החלון הפקודה של Matlab, הפעל את הנהלים הבאים. הפרמטרים הנדרשים כדי להפעיל נהלים אלה מוגדרים בתוכנה ידנית. הפעל PreparePictures לבצע עיבוד מקדים: בעיבוד מקדים, תמונות מסורק מיושרות. בכל צלחת פטרי תיחתך מרצף של תמונות. הזמן שבו כל תמונה נאספה מאוחזר מחותמת הזמן. TLAllPlates להפעיל כדי לבצע זיהוי ומעקב בדוארצלחת פטרי אח בנפרד, מושבות זוהו והוקצתה מספר זיהוי. ניתוח של הנתונים שחולצו: הגדלים של כל מושבה זוהתה נמדד כפונקציה של זמן. כדי לחלץ את הפצת ההופעה של המושבות להשתמש בפונקציות הבאות בחלון הפקודה של Matlab (מידע נוסף זמין בתוכנה הידנית): הפעל ScanLagApp כדי להציג את הניתוח של צלחת פטרי לצד מסוימת בגרף של מושבות גודל לעומת זמן (איור 4). השתמש במחוון כדי לשנות את השעה הנוכחית של הצלחת. גם העיתוי יהיה מצויינים על ידי קו אנכי התאמה על גרף אזור מושבות. לחץ על מושבה כדי לראות העקומה הקשורים אליו, ולהיפך, לחץ על עקומה למצוא המושבה הקשורים אליו. לאחר שזיהה את המושבה, הפנוטיפ יכול להאסף על ידי לקטוף את המושבה מצלחת פטרי שזוהתה. פגמים סינון בניתוח האוטומטי על ידי צ'ולשיר מושבה ולחיצה על לחצן שלא לכלול. כאשר לחיצה להוציא את המספר של המושבה תהפוך צהובה. לאחר שעובר את התוצאות של הניתוח של כל צלחת, לסכם את התוצאות: הפעל AddHistograms ליצור היסטוגרמה של זמני מראה. הפעל plotDeathCurve ליצור ייצוג עקומת הישרדות של ההפצה. הפעל GetAppearanceTimes כדי לקבל את זמן ההופעה של כל המושבות בניסוי.

Representative Results

כדוגמא למיצוי חלוקת זמן השהיה, איור 5 מראה את היכולת של ScanLag לזהות ולעקוב אחר כל מושבה עם מאפיינים ספציפיים על לוח אחד לאורך זמן, כפי שניתן היה לעשות בassay הקרנה. כאשר התרבות של מיקרואורגניזם היא הטרוגנית, האוכלוסיות השונות עלולות לחשוף את עצמם במהלך assay. לדוגמא, איור 6 מציג את כימות מראה ובכך חושף את חלוקת זמן ההשהיה bimodal בזן מוטנטי של א ' coli. קצב הגידול של התאים משפיע על זמן הופעתה של המושבה. כאשר מושבות לגדול באותו קצב, את המראה מאוחר ניתן לייחס לזמן ההשהיה (איור 7). כדי לאמת שהשיטה אכן מודדת את זמן השהייה של תאים בודדים, השווינו תוצאות עם אלו המתקבלות ScanLag באמצעות מיקרוסקופ תא בודד; אימות זה היא יורדribed בפירוט בפרסום קודם 7. שיטה זו מאפשרת ניטור של רבים יותר תאים מאשר יכול להיות מוערך במיקרוסקופ. ההפצות שהושגו באמצעות מיקרוסקופיה והושג באמצעות ScanLag חופפות במידה רבה. הפצת ScanLag היא מעט רחבה יותר; ניתוח תיאורטי לחזות ההרחבה להיות מסדר גודל של סטיית התקן של זמן החלוקה. אם זמן צמיחה הוא שונה עבור כל זן, מקורו של העיכוב בהופעה חייב להיחקר יותר בשיטות אחרות. ההשפעה של מושבות המופיעים מוקדם במראה של מושבות מאוחר יותר נבדקה. ניסויי בקרה 7 אישרו כי הופעתו מאוחר יותר לא נפגע כל עוד את המספר הכולל של מושבות בכל צלחת לא יעלה על 200 (איור 8). ניסוי שליטה נוסף אישר כי מיקומה של המושבה על הצלחת לא היה משפיע על זמן ההופעה שלה 7. הניתוח של plates הוא מכויל לסף מסוים שאולי צריך שינוי בהתאם לחומרים מזינים הנמצאים במצע גידול או הסוג של בקטריה. עם זאת, הניתוח הוא די חזק למגוון גדול של ספים כפי שמוצגים באיור 9. איור 1. תרשים סכמטי של השלבים הדרושים ליצירת הפצת מראה מושבה. איור 2. צילום מסך של מנהל ההתקנים מראים את השמות של הסורקים המצורפים, ושל קובץ התצורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה. איור 3. צילום מסך של מנהל הסריקה. איור 4. צילום מסך של ScanLagApp. תמונה של הצלחת היא בחלונית הימנית, ועקומות הגדילה של כל מושבה נמצאות בחלונית הימנית, כמפורט במדריך. הקוצים בחלק מעקומות אזור המושבות להתרחש כאשר שתיים או יותר מושבות למזג. כאשר ההתמזגות של מושבות קורה, השטח של מושבות אלה נחשב כמשותף באזור. איור 5. תוצאת נציג הניתוח של צלחת אחת. () תמונה של הפלט של יישום זיהוי בסוף הניסוי. כל אזור מושבה מזוהה, צבעוני והוקצה עם מספר זיהוי ייחודי. החיצים מצביעים על מושבות נציג נמדדו בב 'המושבה מזוהה מבוססת על סף עוצמה (למושבות החיידק על אגר LB או אגר M9 סף זה הוא 0.03. לתקשורת או חיידקים אחרים, סף זה יכול להיות מותאם בProcessPictures הפונקציה ). רק אובייקטים מעל 10 פיקסלים נספרים (סף זה יכול להיות שונה בMatchColonies הפונקציה). זיהוי של מושבה מתחיל בכ 10 5 חיידקים. מגרשים (ב ') באזור בפיקסלים לעומת הזמן של ארבע מושבות נציג בצלחת זו. "זמן המראה" של כל מושבה הוא כאשר המושבה מזוהה. "זמן הצמיחה" של כל מושבה מוגדר כאן כזמן לגדול לכאן ולכאןמ '20 פיקסלים 80 פיקסלים (גבולות אלה הם מתכוונן באמצעות הפונקציה getAppearanceGrowthByVec). התוכנה אינה כוללת את המושבות שהתמזגו לפני שהגיע לגבול העליון. זיהוי של מושבה ספציפית לפי מאפייניו הוא הודות קל את מספר זיהוי ואת הצבע שהוקצה לכל מושבה. לדוגמא מושבות # 1, 56, 77 ו124 מודגשים בשני הגרפים. איור 6. כימות מראה יכול לחשוף חלוקת זמן השהיה bimodal. השוואת היסטוגרמות ניתוח ScanLag פעמים מראה לשני זנים שונים. קו כחול: מתח סוג בר אקספוננציאלית גובר (סה"כ: 1,320 מושבות); המוטציה קו אדומה גבוה התמדה מועשרת בחיידקים מפגרים (סה"כ: 1,529 מושבות). () היסטוגרמות מראה מנורמלות. השיאהופעה של תאים גדל באופן אקספוננציאלי הוא הזמן האופייני לגדול למושבה לזיהוי. הבלעה: אותו היסטוגרמה של הזן מוטנטי לאחר הפחתת הזמן של השיא של תרבות מעריכי כדי לקבל את זמן השהיה בפועל על פחים ברווח יומן המציגים את התפלגות זמן ההשהיה bimodal. (ב) פונקצית הישרדות של אותם נתונים כמו ב() בקנה מידת לוגריתמים. ייצוג זה משפר את זנב ההופעה המאוחר של המתח שעבר מוטציה. איור 7. הפצת מראה וחלוקת זמן צמיחה. (א) ו (ב) מראים שתי היסטוגרמות ממדיות של זמן המראה וזמן הצמיחה של שני תנאים שונים (התוכנה אינה כוללת מושבות שהתמזגו לפני שהגיע לגבול העליון). (ג) השוואה בין היסטוגרמותשל שני הזנים להראות את ההבדל בזמן הופעה, ואילו הפעמים הצמיחה (ד ') הן דומות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 8. המראה של מושבות מוקדמות לא מפריע למראה של מושבות מאוחר יותר. () ל"ג בהפצה של wild-type תאים מצופים לבד זמן. (ב) ל"ג בהפצה של זן רגיש קר לבד זמן, לאחר העברה לטמפרטורה מתירנית. (ג) ל"ג בהפצה של שני הזנים מצופים יחד תחת אותם תנאי זמן. הקו השחור מייצג את ההתפלגות הצפויה המבוססת על נתונים המתקבלים בעת מדידת כל זן בנפרד. טובgreement בין הפצות צפויות ונמדדו מתקבל כל זמן שהמספר הכולל של מושבות בכל צלחת הוא מתחת 200. .. איור 9 סף הגילוי אינו משפיע על צורת התפלגות מראה המושבה הפצת מראה המושבה נותחה עבור אותו סט נתונים באמצעות שני גדלי סף שונים; (א) גודל סף הוא 10 פיקסלים; גודל סף (ב ') הוא 50 פיקסלים. מספר התאים להיסטוגרמה: כ. 1,500. סף הגילוי שונה תוצאות רק בשינוי של זמן זיהוי. איור ACR מדידות יציבות 10. טמפרטורהתמונת פני השטח של הסורק ה-OSS. (א) לצלחת עם מושבות של subtillis Bacillus גדל על הסורק ללא ניהול צריכת חשמל. פני השטח הוא חם יותר בתחתית ולכן המושבות לצמוח מהר יותר. הקו ההדרגתי לצד הצלחת הוא ייצוג סכמטי של שיפוע החום. (ב) יציבות הטמפרטורה נמדדה עם שני צמדים ממוקמים על פני השטח של הסורק. הסורק מתחמם במהלך כל סריקה ומעל הזמן. (ג) עם ניהול צריכת חשמל, הטמפרטורה אחידה והמושבות לגדול בשיעורים דומים. (ד) אותו כ( ב ') עם מודול ניהול צריכת החשמל. יציבות טמפרטורה של ± 0.2 ° C. איור 11. הבדלים בהתפלגות המראה יכולים להיות בגלל differences בהיקפי בינוני מוצק. אותה תרבות החיידקים הייתה מצופה על צלחות עם כמויות שונות של אגר LB, וכתוצאה מכך לגובה של משטח אגר שונה. הגבהים השונים הובילו לאטימות שונות של הצלחות, ולכן זמן זיהוי שונה. ההבדל בין הצלחות נבדק ואת ההבדל בין תנאי גובה שונים. (א) הבדלים אופייניים בין הצלחות של כמויות שווה של 30 ± 0.5 מיליליטר של LB אגר. הבדל (ב ') בין תנאי גובה שונים: הפצת המראה נמדד לצלחות עם כרכים של 20 ± 0.5 מיליליטר (אדום), של 30 ± 0.5 מיליליטר (ירוק) ושל 40 ± 0.5 מיליליטר (כחול). כל תנאי הוא הממוצע של 6 צלחות שונות. כל עוד את עוצמת הקול של הצלחות היא בתוך הטווח ± 5 מיליליטר, האטימות היא דומות ומובילה להפצה דומה בזמן הופעה.

Discussion

שיטות מיקרוסקופיות המבוססות על התבוננות ישירה נחשבות לעתים קרובות "סטנדרטי זהב" לחקר תא בודד התנהגות. ScanLag, המאפשר מדידה של חלוקת פעמים בפיגור באוכלוסיות חיידקים, מספק נתונים בהסכם טוב עם החלוקה שהתקבלה מניתוח תא בודד ומשיג הנתונים הסטטיסטיים גבוהים בהרבה.

כמה שלבים קריטיים צריכים להתבצע בשיטה זו כדי לעבוד היטב: ראשית, לא מתפשר על הרזולוציה של הסורק, שאמורה להיות 4,800 x 9,600 להשיג תמונות טובות. שנית, להיות מודע לכך שללא מודול ניהול צריכת החשמל (שלב 1.6), שיפוע הטמפרטורה עלול להתפתח על פני השטח השטוח ומשפיע על צמיחה. צעד חשוב נוסף הוא הסינון של ליקויים כגון אבק שייתכן שנספרו בטעות כמושבות על ידי התוכנה. חיסור הרקע המובנה של התוכנה בדרך כלל מתגבר על פגמים אלה, אבל יש לי מושבות לפעמים "שקר" ללהיות מסונן באופן ידני.

השלבים לפתרון בעיות העיקריים עשויים לטפל וריאציה בין צלחת בהתקנה, בשל מספר סיבות: (א) שיעור הצמיחה של מיקרואורגניזמים מושפעים טמפרטורה. תנאי טמפרטורה ולחות שונים יכולים להתרחש עקב אוורור או מיקום לא אחידים של המנה בחממה. (ב) האלקטרוניקה של הסורק עלולה להתחמם ולגרום לשיפוע טמפרטורה על פני השטח של הסורק. איור 10 מראה את ההשפעה של שיפוע חום מרחבית כגון בחיידקי Bacillus, יחד עם המדידות של הטמפרטורה על פני השטח הסורק לפני ו לאחר יישום מודול ניהול צריכת החשמל (שלב 1.6). שים לב שמודול זה לא יכול להיות הכרחי לסורקים חדשים יותר, ואם רק חלק ממשטח הסורק משמש, ניהול צריכת חשמל עשוי להיות מיותר. (ג) צלחות עם אטימות של חומר מזין אגר שונות עלולות להוביל לרמות זיהוי שונות. איור 11 מופעים הסובלנות דואר לכרכים שונים של אגר מזין כי תוצאת אטימות שונות.

בניסוי טכניקת ScanLag היא קלה לביצוע ודורשת רק לצלחת מיקרואורגניזמים על צלחות פטרי סטנדרטיות, ולמקם אותם על פני השטח של הסורק. התוכנה שפותחה שולטת על ההליך כולו. רכישת התמונה נעשית באופן אוטומטי, וניתוח התמונה למעקב מושבה הוא גם אוטומטי. יתר על כן, המערכת יכולה להיות מדורגת למעלה כדי למדוד תנאים רבים ושונים באותו הזמן. לבסוף, השיטה מסתמכת על סורקי משרדים ומסחר, ולכן היא בעלות נמוכה.

טכניקה זו ניתן להרחיב את המחקר של מיקרואורגניזמים השונות מE. coli K-12, עם זאת כמה שיקולים צריכים להתבצע. ראשית, השפעתה של מושבות המופיעות בשלב מוקדם במאוחר אלה יש להעריך, כפי שתואר בפירוט בפרסום קודם 7. עבור א ' Coli K-12,צפיפות המרבית של CFU לכל צלחת היא 200. זנים אחרים עם גדלים שונים של מושבות, ולדבר לחצות אפשריים אחרים בין מושבות, עשוי לחייב צפיפות שונה. שנית, הניתוח של הצלחות הוא מכויל לסף מבוסס תוכנה ספציפית שעשויות צריך להיות שונה, בהתאם לניגוד בין המדיום המוצק והמושבות. התוכנה יכולה להתארך גם כדי לחלץ מאפייני מושבה אחרים, מעבר לפיגור וקצב צמיחה. קוד התוכנה פתוח והוא יכול להיות שונה כדי לחלץ צורת מושבה, בהירות, חלקות וצבע.

כי מדידות מבוצעות על מושבות שמקורם תאים בודדים, הנתונים חושפים פנוטיפים חדשים שלא ניתן למדוד על ידי מדידות ברמת אוכלוסייה. החשיבות של חלוקת זמן ההשהיה מתגלה בנוכחות של אנטיביוטיקה. אנטיביוטיקה רבות ידועות להיות יעילים רק נגד תאים הולך וגדל; לכן, כל עוד תאים נשארים בשלב הפיגור ולא גדלים, הם פרוtected מהשפעות של אנטיביוטיקה אלה 21. כאשר המספרים של חיידקי ניצול מוערכים במרווחי זמן במהלך טיפול אנטיביוטי 15,22,23, subpopulation של חיידקים, הנקרא persisters, מתגלה לעתים קרובות. במקרים מסוימים, חסינות לטיפול אנטיביוטי נובעת מפיגור ממושך. שימוש בהגדרה זו, הפיגור הזה מתגלה ולעתים קרובות יש חלוקת הלא טריוויאלי 24 (איור 6). שיטה זו גם מאפשרת שליפה של מוטציות נדירות. לדוגמא, לאחר ציפוי אוכלוסיית mutagenized, ניתן לזהות מוטציות המבוססות על הפנוטיפ ומבודד באופן ישיר, ללא בחירה. ההתקנה יכולה גם לעקוב אחר תאי תאי אינטראקציות על ידי מדידת הצמיחה של מושבות כפונקציה של צפיפות מושבות סמוכות ולכמת תופעות כגון חישת מניין או ההתפשטות של חיידקים שורצים. מידע רב ממדי שנחשף על ידי ניסויים עתידיים בשיטה זו יוביל לאפיון טוב יותר של אוכלוסיית חיידקיםים ולהתקדמות במחקר רפואי וסביבתי.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

Materials

Name of Material Company Catalog Number Comments/Description
Bacto Agar BD 214010
Difco LB broth BD 240230
Petri dish 90mm Miniplast 20090-01
Name of Equipment
Epson Perfection v37 Epson B11B207201 Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution: 4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.
Epson Perfection v200 Epson B11B188011
Epson Perfection 3490 Epson B11B177011
ADU200 USB Relay ONTRAK
pieces of sterile black felt cloth custon made approximatly 100 x100 mm
white plate holders custon made surface size, with 6 x 99mm diameter hole
Delerin rings the size of the Petri dish custon made inner diameter: 72 mm
outer diameter: 86 mm
top outer diameter: 90 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).
  2. Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).
  3. Penfold, W. J. On the Nature of Bacterial Lag. J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).
  4. Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
  5. Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
  6. Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
  7. Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
  8. Lewis, K. Persister cells. Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).
  9. Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
  10. Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
  11. Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
  12. Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
  13. Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
  14. Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
  15. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  16. Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
  17. Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
  18. Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
  19. Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
  20. Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
  21. Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
  22. Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
  23. Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
  24. Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).

Tags

Colony GrowthLag TimeGrowth DynamicsMicroorganismsHigh-throughputQuantificationScanLagAutomated ImagingColony DetectionGrowth RatePhenotypic Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Levin-Reisman, I., Fridman, O., Balaban, N. Q. ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time. J. Vis. Exp. (89), e51456, doi:10.3791/51456 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image