Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bestemmelse af Spontan motorisk aktivitet i Published: April 10, 2014 doi: 10.3791/51449
Automatic Translation
1, 1, 1
1Genetics and Developmental Biology, School of Medicine, University of Connecticut Health Center

Summary

Drosophila melanogaster er anvendelige til at studere genetiske eller miljømæssige manipulationer, der påvirker adfærd, såsom spontan lokomotorisk aktivitet. Her beskriver vi en protokol, der bruger skærme med infrarøde stråler og data analyse software til at kvantificere spontan motorisk aktivitet.

Abstract

Drosophila melanogaster er blevet anvendt som en fremragende model organisme for at studere miljømæssige og genetiske manipulationer, der påvirker adfærd. En sådan adfærd er spontan lokomotorisk aktivitet. Her beskriver vi vores protokol, der bruger Drosophila befolkningsgrupper skærme og et tracking system, der tillader kontinuerlig overvågning af den spontane bevægelsesaktivitet af fluer i flere dage ad gangen. Denne fremgangsmåde er enkel, pålidelig og objektiv og kan anvendes til at undersøge virkningerne af aldring, køn, ændringer i kalorieindholdet af fødevarer, tilsætning af lægemidler eller genetiske manipulationer, som efterligner humane sygdomme.

Introduction

Bananfluer, Drosophila melanogaster, er blevet brugt som en værdifuld model organisme for at studere mekanismerne bag komplekse adfærd, såsom indlæring og hukommelse, social interaktion, aggression, stofmisbrug, sove, sensorisk funktion, frieri og parring 1,2. En adfærd, der er blevet undersøgt gennem flere protokoller er spontan motorisk aktivitet. Negativ geotaxis var en af de første metoder, der er udviklet til måling af Drosophila-aktivitet, og denne protokol indebærer måling af procentdelen af fluer, når en vis højde på hætteglasset efter fluer blev rystet til bunden af beholderen med 1,3. Denne metode har fordelene ved at være enkel, billig, og da den ikke kræver noget særligt udstyr kan udføres i enhver laboratorium. Det har været anvendt som et værdifuldt screeningsværktøj til at studere virkningerne af forskellige genetiske manipulationer på fly mobilitet 3. Men det er tids-og arbejdskrævende ennd har mulighed for bias som følge af variabel omrystning af hætteglassene og menneskelige optagelser.

Den negative geotaxis blev forbedret, ved udviklingen af den hurtige Iterativ Negativ Geotaxis (RING) metode 4,5, der tager fotografier af fluen hætteglas efter ryster af fluerne til bunden. Fordelen ved denne protokol er dens følsomhed og muligheden for at teste et stort antal flyve hætteglas på samme tid. Men denne protokol har stadig potentiale for menneskelige fejl, og kun måler negative geotaxis. Andre laboratorier har brugt simpel observation i kultur hætteglas at bestemme bevægelsesaktiviteten 6.

For nylig flere videooptagelse systemer til måling af flue bevægelsesaktiviteten er blevet udviklet. Én videoovervågning protokol giver tid til tilpasning, før du optager 7. Beskrevet af Slawson et al. Anvender desuden en luft-impuls til at stoppe movement indtil starten af optagelsen, som potentielt kunne være en stressfaktor for dyrene 7. Denne metode giver information om gennemsnitshastighed, max hastighed, tid tilbringer i bevægelse, osv. En anden tredimensionel tracking system måler den maksimale hastighed af individuelle fluer under ~ 0,2 sekunder i fri flugt start 8.. Et tredimensionalt videoovervågning protokollen bruger fluer udtrykker GFP og flere kameraer udstyret med filtre, der muliggør påvisning af fluorescens til at bestemme flue mobilitet 9. Fluer i denne protokol tendens til at udvise cylindriske flyvning mønstre, som er potentielt på grund af formen af Drosophila kultur hætteglas 10. Denne fremgangsmåde blev forbedret ved hjælp af en kuppel, der tillader måling af spontan bevægelse af to fluer 11. En high-throughput metode, der bruger et kamera til automatisk at overvåge og kvantificere de individuelle og sociale adfærd Drosophila er også blevet beskrevet 12. Zou etal. udviklet et system, adfærdsmæssige monitor (BMS), der bruger to computer-assisteret kameraer til at optage levetid adfærd og bevægelser såsom hvile, bevæger sig, flyvende, spise, drikke eller dødsfald blandt individuel tephritid bananfluer 13. Flere andre video-systemer er blevet udviklet til at overvåge flyve adfærdsmæssige aktivitet 14,15.

Her beskriver vi en fremgangsmåde til kvantificering af Drosophila aktivitet, der udnytter befolkningsgrupper skærme. Disse skærme er opstaldet i temperatur-og fugtigheds-kontrollerede inkubatorer ved 25 ° C på en 12 timers dag-nat lys cyklus. Hver population skærm har infrarøde stråler placeret i ringe placeret på tre forskellige højder. Hver gang en flue bevæger sig hen over ringene afbryder den infrarøde stråle, der registreres af en mikroprocessor, som selvstændigt registre og tæller aktiviteten af ​​fluer inde i hætteglasset. En mikroprocessor uploader den samlede aktivitet inden for hætteglasset til computeren ved brugerdefineret intervaEr det kunne variere fra 1 sekund til 60 minutter. Den her beskrevne metode giver rigelig tid til fluer til at tilpasse sig det nye miljø og giver mulighed for samtidig måling af spontan motorisk aktivitet af så mange som 120 populationer af fluer. Derudover beskriver vi forberedelse af fødevarer, flyve vedligeholdelse, opsætning af mobilitet befolkningsgrupper skærme i temperaturkontrollerede inkubatorer og potentielle faktorer, der kan påvirke resultatet. Denne metode kan bruges til at undersøge, hvordan forskellige miljømæssige eller genetiske modifikationer påvirker spontan motorisk aktivitet af fluerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Den Canton-S stammen er den standard vildtype baggrund linje opnået fra Bloomington Stock Center.

1.. Fødevarer Forberedelse og opskrift til 1.000 ml Food

Bemærk: Dette afsnit beskriver den protokol til tilberedning af mad. Store metal potter bruges til at forberede omkring 18 L af fødevarer på et tidspunkt. Den her beskrevne protokol nedprioriteret og bruger 1.000 ml H 2 O. Fødevarer er autoklaveret to gange.

  1. Bland 113 g sukker og 28 g ølgær i 643 ml vand. Efterlad ingredienser på en varmeplade indstillet ved 25 ° C med en blandestift hele i 15 minutter.
  2. Autoklave fødevarer opløsning i 20 minutter.
  3. Bland 49 g majsmel og 8,1 g agar i 268 ml vand og tilsættes den autoklaverede madblandingen beskrevet i trin 1.2. Bland godt med en stor ske eller et piskeris.
  4. Autoklave blanding fødevarer i yderligere 20 minutter.
  5. Anbring maden på en tallerken og lad køle ned med konstant blanding med en rørepind. Jegf der bør tilføjes yderligere løsninger til fødevarer, såsom mifepriston (RU486), holde maden på en varmeplade oprettet ved 60 ° C og tilsæt løsning, når maden når den ønskede temperatur.
  6. 2,4 g tegosept opløses i 10,7 ml 100% EtOH og holde på en kold plade med en omrører opløses fuldstændigt, og der blandes i ca 15 min.
  7. Tilføj tegosept løsning til fødevarer, når temperaturen af ​​fødevarer er 60 ° C og bland godt.
  8. Brug en pumpe eller en fødevare dispenser til at hælde omkring 10 ml fødevarer i en bred hætteglas. Ved hjælp af en fødevare dispenser kan man hælde fødevarer samtidigt i 100 brede plastflasker (1 bakke) ad gangen.
  9. Dæk hætteglas med Kimwipes og ost klud og lade mad ved stuetemperatur i 12-24 timer til at køle ned. Holde maden ved 4 ° C og anvendes inden for 3-4 uger. Varm op mad til stuetemperatur før brug for flyve arbejde.

2. Fremstilling af hætteglas

  1. Forbered fødevarer i henhold til den protokol, der er anført i trin 1. Alikvot 5 ml mad i hvert smal, hætteglas, som er den korrekte størrelse for de befolkningsgrupper skærme. Dette beløb af fødevarer bør være lav nok til at være under den laveste ring af befolkningen skærmen.
  2. Efter maden køler ned til stuetemperatur dække hætteglas med svamp propper og holde dem ved 4 ° C i op til 2 uger. Fordi mængden af ​​fødevarer i et hætteglas er temmelig lav, er det bedst at bruge fødevarer inden for en uge eller to for at forhindre udtørring.
  3. Varm op hætteglassene til stuetemperatur før brug.

3.. Vedligeholdelse af Forældrekontrol Flies

  1. Grow fluerne i brede plast hætteglas med standard laboratorium mad og holde hætteglassene i en fugtig, temperaturstyret miljø kammer ved 25 ° C på en 12 timers lys / mørke-cyklus. Perioden dagslys starter ved 6:00 i dette laboratorium.
  2. Om morgenen klar voksen flyver fra hætteglassene, hvorfra forældrenes fluer vil blive indsamlet.
  3. Saml nyligt eclosed flies og adskille dem efter køn på en CO 2-pad indenfor 8 timer efter eclosion at sikre, at de kvindelige fluer er jomfruer. Fluer begynder at parre 8 timer efter eclosion.
  4. Når jomfruelige mandlige og kvindelige fluer er mellem 5 og 10 dage gamle, satte 10 hanner og 10 kvindelige fluer i et hætteglas med standard mad og flere korn af aktivt gær på toppen.
    Bemærk: kontrollere densiteten af ​​larver ved hjælp af det samme antal fluer og holde dem i et hætteglas i to dage. Tilsætning af aktiv gær fremmer ægproduktionen.
  5. Holde fluerne at parre sig og lægge æg i en temperatur-kontrolleret miljøkammer ved 25 ° C med en 12 timers lys / mørke-cyklus i 2 dage. Opsætning 5-10 hætteglas med forældrenes fluer.
  6. Pass fluerne til en ny plast hætteglas hver anden dag og holde hætteglas med æg i en inkubator ved 25 ° C.

4.. Indsamling af Eksperimentelle Flies

  1. Efter 9 dage fluer vil begynde at Eclose fra hætteglassene hvor Parental fluer lagt æg (beskrevet i trin 3.6.). Klar og kassere de fluer, der eclosed løbet af den første dag og returnere glassene til inkubatoren. De fleste af de fluer eclosed på dag 1, er kvinder. En mere synkroniseret population af fluer vil Eclose på dag 2..
  2. Inden for 24 hr sted nyligt eclosed fluer på CO 2 puder og indsamle 25 mandlige og 25 kvindelige fluer per hætteglas med en pensel eller ske metal. Hold fluer på CO 2-pads i en kort periode for at minimere effekten af CO 2. Skriv ned den dag eclosion på hætteglasset. Saml mindst 5 replikat hætteglas til eksperimentel og kontrolgrupper.
  3. Opbevar hætteglassene i temperaturstyrede miljøkamre ved 25 ° C med en 12 timers lys / mørke-cyklus.
  4. Pass fluerne til en ny plast hætteglas hver anden dag ved hjælp af en tragt.
  5. Alder fluerne indtil den ønskede alder for eksperimenter er nået.

5.. Opsætning mobilitetscentrene skærme

  1. Placerbefolkning overvåger i en temperatur-kontrolleret inkubator.
  2. Forbind hver skærm med en 4-leder telefonkabel til Power Supply interface Unit (PSIU) via 5-vejs splitter (flere linjer), som kan tilslutte op til 5 individuelle skærme til en åbning i PSIU. Se figurerne 1A og 2B.
  3. Slut PSIU til en linje stikkontakt (100-240 V). Sæt strømforsyningseffekten stik i en af ​​de 2 parring PSIU stik. Den tilstødende grønne lys lyser grønt når den er tilsluttet korrekt.
  4. Slut PSIU til Universal Serial Bus (USB) hardware. Tilslut USB-kablet mellem USB-hardware med et Macintosh-eller en Windows-PC til dataregistrering. Det ville være bedst at have en computer dedikeret kun til indsamling af data, da indsamling kører i flere dage ad gangen.
  5. Download USB-software (PSIUdrivers.zip). USB-driver software bruges af Power Supply interface og skal downloades én gang. Det syntetiserer endatalink mellem edb-programmet og PSIU / aktivitets-skærme. For en pc-brug en COM-port og en Macintosh bruge en simpel seriel port.
  6. Download edb-program til Macintosh OSX (Intel) eller til Windows PC (XP/Vista/7) programmer ved at følge instruktionerne fra producenten Notes 308.pdf.
  7. Start computeren programmet og konfigurere programmet ved at klikke på Indstillinger, Lys eller monitorer. Programmet løber indtil brugeren vælger "quit" for at stoppe programmet. Hvis computeren programmet eller computeren er lukket ned skærmene vil fortsætte med at tælle beam afbrydelser, men de tæller, vil ikke blive optaget, indtil programmet er re-lanceret. I dette tilfælde den første læsning vil omfatte alle tællingerne siden sidste gang PSIU sendt data til computeren.
  8. Vælg fanen Indstillinger og vælge den seriel port, PSIU til Macintosh og COM til PC.
  9. Vælg læsning interval, der spænder fra sekunder, minutter, eller en time.
    10. <li> Vælg skærme: Hver skærm har et unikt nummer, der er givet af producenten. Vælg den Skærm-Range, der svarer til de tal, der gives til de skærme af producenten.
  10. Den Lights box: Sørg for at alle skærme er tilsluttet korrekt, som er præget af et grønt lys ved siden af ​​monitor nummer på softwaren. Et rødt lys angiver, at forbindelsen er tabt, og en sort boks indikerer, at systemet er slukket eller forkert sat op.

6.. Opsætning af eksperimentet

  1. Fjern hætteglas med fødevarer fra 4 ° C og lade dem varme op til stuetemperatur.
  2. Separate mandlige og kvindelige fluer på samme alder på CO 2 pad. For aldring undersøgelser er det muligt at starte mobilitet studier så tidligt som 3 dage gamle.
  3. Put 10 mand eller 10 kvindelige fluer i hvert hætteglas indeholdende mad. Brug mindst tre hætteglas for hver forsøgs-og kontrol linje af fluer og for hvert køn.
  4. Hold VIals på deres side, indtil fluerne tilbagesøge CO 2 for at sikre fluerne ikke sidde fast i maden. Separate fluer på omkring 08:00 og efterlade dem i ca 2 timer ved stuetemperatur for at komme ud fra CO 2.
  5. Placér glassene inde befolkningstallene monitorer opstaldet i væksthuse.
  6. Kassér de indsamlede inden for de første 24 timer data efter fluerne sættes i inkubatoren at lade dem tilpasse sig den nye omgivelser.
  7. Pass fluerne efter 3 eller 4 dage til nye hætteglas for at undgå udtørring af maden. Hvis fluer er tilbøjelige til døden eller er alder 40 dage eller ældre, passerer fluerne efter 2 dage og anvende data indsamlet til dag 2.. Også bruge mere end tre hætteglas pr gruppe til at sikre tilstrækkelige gentagelser. Bør der ses bort Data fra hætteglas med døde fluer og ikke indeholdt i analysen.

7.. Kørsel Aktivitetsmonitorerne og beregningen af ​​det samlede Spontan aktivitet

  1. Vælg præferencer - intervallet for dataindsamling <.br /> Bemærk: Computerprogrammet muliggør indsamling af data med intervaller fra 1 sekund til 60 minutter. 10 og 30 minutters perioder har vist sig at tilvejebringe tilstrækkelig information om mobilitet uden at have et overvældende antal tidspunkter. På den valgte periode, vil programmet sende det aktuelle samlede antal for hver skærm til computeren og begynder igen at tælle fra nul. Computerprogrammet gemmer data i en ny mappe oprettet af edb-data-system. De indsamlede i hver skærm lagres separat, og de enkelte tekstdokumenter er skabt til hvert hætteglas. Dataene er kontinuert opsamlet, så længe program fungerer.
  2. Ved afslutningen af ​​forsøget, scanne data ved hjælp af FileScan110X til Macintosh OSX (Intel) eller SystemMB108 til Windows PC (XP/Vista/7) program.
    Bemærk: Scan program fjerner dublerede aflæsninger og gør sikker på, at optagelserne er færdige.
  3. Gem de indsamles inden en bestemt tid og p-dataeriod dage. Vælg en eksperimentel navn og kopiere filerne fra mappen Data til analyse computer.
    Bemærk: På dette tidspunkt, kan aktivitet intervaller ændres og omdannes til forskellige. De oprindelige data vil forblive gemt i mappen edb-data og kan hentes, så længe de ikke bliver slettet.

8.. Dataanalyse

  1. Kopier de indsamlet i tekstfiler data i kolonner af Excel-regneark til dataanalyse. Data indsamlet af denne software er i kolonner, som indeholder tal, der repræsenterer den samlede aktivitet i en enkelt skærm i løbet af en periode, valgt af investigator.
    Bemærk: Data indsamlet for hver skærm er i separate tekstfiler. Der er 32 kolonner for hver skærm. De første seks kolonner er tomme, og kun indeholde 0; næste tre indeholde de data, der er indsamlet i bunden ring, i midten, og øverst ringen. Resten af ​​kanalerne kan slettes, da de ikke indeholder nogen data. Hver ring afgiver etenkelt værdi per tid. Se skærmbillede af de rå data i figur 2.
  2. Beregn den samlede aktivitet inden for et ønsket tidsrum for hver skærm, der repræsenterer summen af ​​aktivitet indsamles på tre forskellige højder af infrarøde stråler.
    Bemærk: Tidsperioden kan variere fra flere timer, 24 timer eller flere dage.
  3. Bestem den gennemsnitlige motorisk aktivitet og standardafvigelsen mellem de 3 skærme, der repræsenterer 3 biologiske gentagelser.
    Bemærk: De data kan analyseres for statistisk signifikans ved hjælp af en række tests. En to-tailed Students t-test, en envejs variansanalyse (ANOVA) og en Tukey HSD post hoc-test kan bruges til at bestemme virkningerne af flere miljømæssige eller genetiske manipulationer på 24 timer spontan motorisk aktivitet 16. Der er en række andre programmer, der kan anvendes, og er tidligere blevet offentliggjort 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den spontane bevægelsesaktivitet i Drosophila afhænger flue køn (figur 3A), indhold af fødevarer (figur 3B) kalorie og lys / mørke-cyklus. Når lyset er slukket flyve aktivitet falder dramatisk. 3A illustrerer 24 timer bevægelsesaktiviteten optagelser af mandlige og kvindelige fluer. En stjerne på x-aksen markerer det tidspunkt, hvor lyset blev slukket og overgangen til mørke cyklus. 3B illustrerer standardafvigelsen mellem den gennemsnitlige spontan motorisk aktivitet samlet i tre befolkningsgrupper skærme til mænd flyver alder 3 dage på majs mad. De indsamlede data for det spontane fysisk aktivitet under de 24 timer, data kan også udtrykkes som den samlede aktivitet pr flue i løbet af en 24 timers periode, figur 3C.

_upload/51449/51449fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51449/51449fig1.jpg "/>
Figur 1:.. Befolkning monitor setup for overvågning af spontan motorisk aktivitet af fluer A) Flere befolkningsgrupper skærme er tilsluttet med et 4-leder telefonkabel til 5-vejs splittere og anbringes i et temperatur-kontrolleret inkubator B) Højere forstørrelse af to befolkning skærme, der viser placering af hætteglassene i befolkningen skærme og tre ringe med infrarøde stråler placeret på tre forskellige højder. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2: Screen shot af de rå data genereret af såftware viser dato, tid og data indsamlet i Ring 1, 2 og 3.. R står for Ring. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3: A) Gennemsnitlig spontan motorisk aktivitet af mandlige (Black) og kvindelige (Magenta) flyver i løbet af 24 timer på standard laboratorium kost. Data er indsamlet i 10 minutter skraldespande og repræsentere gennemsnitlige aktivitet pr flue beregnet som gennemsnit aktivitet mellem tre hætteglas hver indeholdende 10 fluer. B) Gennemsnitlig spontan motorisk aktivitet af mandlige fluer i løbet af 24 timer på standard laboratorium kost. Data er indsamlet i 10 minutter skraldespande og repræsentere gennemsnitlige aktivitet pr flue beregnet som gennemsnit aktivitet mellem three hætteglas. Standardafvigelser er markeret med grønt. C) I alt aktivitet på 20 dage gammel mand fluer på lavt kalorieindhold (0.5x) (grøn) og højt kalorieindhold (1,5 x) (Brown) fødevarer over 24 timer. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spontan bevægelsesaktivitet af fluer er påvirket af mange faktorer såsom alder, genetisk baggrund og køn 2,13,18,19. Derudover kan miljømæssige faktorer såsom kalorieindholdet af mad, omgivelsernes temperatur, tilsætning af forskellige stoffer og dag / nat lyscyklus påvirke flyve aktivitet. For eksempel mandlige fluer på samme alder har en højere spontan fysisk aktivitet i forhold til kvinder (figur 1). Derfor bør fluer af samme alder og køn sammenlignes med hinanden. Ved undersøgelsen af ​​effekten af ​​genetiske manipulationer på fly aktivitet, såsom overekspression eller tab af funktion af et bestemt gen, skal de eksperimentelle og kontrol fluer være i den samme genetiske baggrund for at fjerne eventuelle potentielle virkninger af forskellige genetiske baggrund eller andet sted modifikatorer. Dette kan opnås ved tilbagekrydsning eksperimentelle kvindelige fluer til w 1118 eller YW mænd for 10 generationer. Efter 10generationer af tilbagekrydsning kan w 1118 eller YW fluer anvendes som en genetisk kontrol. En anden måde at kontrollere for den genetiske baggrund er at anvende inducerbare GAL4 GeneSwitch (GAL4-GS)-UAS binært system, der tillader overekspression eller nedregulering (RNAi) af genet af interesse i en tid og vævsspecifik måde i fluer fodret fødevarer med tilsætning af mifepriston (RU486) 20,21. RU486 er nødvendig for GAL4 at dimerisere og binde til UAS-sekvensen. Genetiske kontrol søskende fluer holdes på fødevarer med tilsætning af EtOH (RU486 fortyndingsmiddel).

Forskellige metoder er blevet anvendt til at optage Drosophila mobilitet. Den her beskrevne metode er enkel, pålidelig, mere informativ, og har mindre potentiale for bias i forhold til andre metoder, der anvendes til at bestemme Drosophila mobilitet, såsom negative geotaxis. Det har den fordel, at målet samtidig optagelse af flere populationer af fluer i en lang periode istandard dyrkningsbetingelser. Måling lokomotorisk aktivitet ved hjælp befolkningsgrupper skærme kan være nyttig til at undersøge, hvordan forskellige kaloriefattige indholdet af fødevarer påvirker flyve eller at studere genetiske mekanismer til øget aktivitet af fluer på CR 16. Ligeledes er dette system blevet brugt til at studere virkningerne af forskellige genetiske mutationer, aldring, eller tilføjelse af forskellige stoffer på fly spontan fysisk aktivitet. Anvendelse af enkelte rør i stedet for befolkningsgrupper skærme tillader måling af H 2 O 2 modstand i forskellige genotyper af fluer, studere døgnrytmen in vivo, analysere søvn adfærd, og andre 17,22-24.

Ligesom enhver metode, der er begrænsninger for dette overvågningssystem. Ved overvågning af fluer i lang tid, er der et potentiale for flyve død, især hvis hjælp alderen fluer. Brug kun raske fluer vil hjælpe med at forhindre dette. Vi forsøger også at bruge mere end 3 biologiske replikater prgruppe, hvis fluerne er gamle eller tilbøjelige til at dø. En løsning er at holde fluer kun for 2 dage i mobilitets-skærme og anvende data, der er indsamlet i løbet af dag 2, efter fluer har tilpasset sig miljøet. Hvis døden indtræffer vi ikke bruger de indsamlede data for hætteglasset i beregninger af data. Selv om vi har brugt hætteglas placeret kun lodret i Trikinetics Aktivitetsmonitorerne, er der en mulighed for at placere hætteglassene vandret. Vi vælger at placere hætteglas lodret fordi fødevarer er i bunden af ​​hætteglasset, som svarer til standard-inkubator dyrkningsbetingelser. Dette tillader fluer at have mere plads til at gå op og ned hætteglassene, og det er mere ligner negative geotaxis eksperimenter. Bør også overvåges fugtighed inkubatoren hvis fødevarer udtørring bliver et problem 24. Dette system giver data i form af gennemsnitlige aktivitet, og ikke give specifikke oplysninger om karakteren af ​​aktiviteten. Desuden, hvis to fluer krydser strålen på samme tid, er det will kun registreres som én afbrydelse. Protokollen beskrevet her er nyttig til at kvantificere den samlede aktivitet, men andre protokoller kunne give nyttige oplysninger, hvis mere præcise oplysninger, såsom flyvning bane eller hastighed ønskes 12,14,25.

Efter dette eksperiment, vil forskelle i spontan motorisk aktivitet på grund af genetiske eller miljømæssige manipulationer være kendt. En fremtidig ændring af denne protokol kunne være at analysere de forskellige aktivitetsområder fluer i toppen, midten og bunden ringe af befolkningstallene skærme. Dette vil afgøre, om fluen populationer tilbringer det meste af deres tid på bunden af ​​hætteglasset tæt på fødevarer eller på toppen. Protokollen i sin nuværende form giver mulighed for præcise, samtidig kvantificering af spontan motorisk aktivitet af Drosophila eksperimentelle og kontrol befolkninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health (AG023088 til BR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB, Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90471380
Brewer’s Yeast Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90331280
Drosophila Agar Fine SciMart DR-820-25F
Cornmeal Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept Sigma H5501-5KG
EtOH Pharmco-AAPER 111000200
Active Dry Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Fly CO2 pad LabScientific BGSU-7
Stereo Microscope Olympus SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank Airgas UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide Fischer Scientific AS519
Buzzplugs for wide plastic vials Fischer Scientific AS275
Glass vials (25 x 95 mm) Fischer Scientific Kimble 60931-8 AS-574
Sponge plugs for glass vials SciMart DR-750
Drosophila Food Dispenser Applied Scientific (Fischer Scientific) AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
Name Company Catalog Number Comments
DAMFileScan108X software for Macintosh www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip) www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308 (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
  2. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
  3. Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p, Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  5. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
  6. Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
  7. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
  8. Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
  9. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
  10. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
  11. Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
  12. Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  13. Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
  14. Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
  15. Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
  16. Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
  17. Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
  18. Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
  19. Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
  20. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
  21. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  22. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
  23. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
  24. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, Cold Spring Harbor. (2010).
  25. Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).

Tags

Neuroscience Investigative Techniques Life Sciences (General) Behavioral Sciences, Bananfluer Spontan fysisk aktivitet mobilitet Fly adfærd motorisk aktivitet
Bestemmelse af Spontan motorisk aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina,… More

Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449, doi:10.3791/51449 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter