प्रेरित न्यूरॉन्स में वयस्क मानव मस्तिष्क की pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के वंश reprogramming
Summary
प्रत्यक्ष वंश reprogramming के लिए मस्तिष्क निवासी कोशिकाओं को लक्षित मस्तिष्क की मरम्मत के लिए नए दृष्टिकोण प्रदान करता है. यहाँ हम वयस्क मानव मस्तिष्क प्रांतस्था से मस्तिष्क निवासी pericytes के लिए समृद्ध संस्कृतियों को तैयार करने और Sox2 और Ascl1 कारकों प्रतिलेखन के रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित न्यूरॉन्स में इन परिवर्तित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएनएस) में गैर neuronal कोशिकाओं के प्रत्यक्ष वंश reprogramming न्यूरोजेनेसिस अंतर्निहित आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और इन विट्रो मॉडलिंग या रोगग्रस्त मस्तिष्क की मरम्मत के लिए नई रणनीति के लिए सक्षम हो सकता है. INS में प्रत्यक्ष रूपांतरण करने के लिए उत्तरदायी पहचान मस्तिष्क वासी गैर neuronal सेल प्रकार क्षतिग्रस्त मस्तिष्क ऊतक के भीतर यानी, बगल में इस तरह के एक दृष्टिकोण शुरू करने के लिए अनुमति दे सकते हैं. यहाँ हम इस आधार है कि पूरा वयस्क मानव मस्तिष्क से निकाली गई कोशिकाओं की पहचान करने की कोशिश में विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल शामिल है: वयस्क मानव मस्तिष्क की बायोप्सी से प्राप्त सेरेब्रल कॉर्टेक्स से मानव कोशिकाओं की (1) संवर्धन; (2) इन विट्रो (लगभग 2-4 सप्ताह की आवश्यकता होती है) विस्तार और immunocytochemistry द्वारा संस्कृति के लक्षण वर्णन और प्रवाह cytometry; (3) विरोधी PDGF रिसेप्टर β और विरोधी CD146 एंटीबॉडी का उपयोग छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा संवर्धन;(4) तंत्रिकाजन्य प्रतिलेखन साथ रेट्रोवायरस की मध्यस्थता पारगमन Sox2 और ascl1 कारकों; (5) और अंत में immunocytochemistry द्वारा परिणामी pericyte व्युत्पन्न प्रेरित न्यूरॉन्स (PdiNs) का लक्षण वर्णन (8 सप्ताह के लिए 14 दिनों के रेट्रोवायरल पारगमन के बाद). इस स्तर पर, आईएनएस पैच दबाना रिकॉर्डिंग से उनके बिजली के गुणों के लिए जांच की जा सकती. इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक मानव INS में मस्तिष्क निवासी pericytes की इन विट्रो वंश रूपांतरण के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की प्रक्रिया में हैं.
Introduction
बदले में भेदभाव क्षमता की अधिकता के साथ संपन्न हो जो प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में दैहिक कोशिकाओं (iPSCs), के reprogramming के लिए विरोध के रूप में, प्रत्यक्ष reprogramming दूसरे में एक विशेष सेल प्रकार के सीधे रूपांतरण के लिए करना है. रोग मॉडलिंग और संभावित सेल आधारित चिकित्सा के संदर्भ में उनके आवेदन के संबंध में, दोनों reprogramming दृष्टिकोण विशिष्ट फायदे और नुकसान है. IPSCs (मैं) में Reprogramming कोशिकाओं का एक लगभग अनंत स्रोत प्रदान करता है; (Ii) जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए अनुमति देता है; (Iii) एक लगभग असीमित भेदभाव की क्षमता के साथ endows. इन कोशिकाओं सेल आधारित चिकित्सा के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं हालांकि, अगर iPSCs के बड़े नुकसान undifferentiated कोशिकाओं (vivo में teratoma गठन) की tumorigenicity और पूर्व vivo खेती और बाद प्रत्यारोपण के लिए जरूरत के जोखिम शामिल. इसके विपरीत, प्रत्यक्ष वंश reprogramming वांछित कोशिकाओं की कम उपज के द्वारा प्रतिबंधित हैशुरू करने से जनसंख्या के लक्षित कोशिकाओं की संख्या के साथ सीधे संबद्ध है, लेकिन वंश reprogrammed कोशिकाओं के प्रत्यारोपण 1,2 पर कोई tumorigenic जोखिम प्रदर्शन करने के लिए दिखाई देते हैं कि लाभ के पास जो; इसके अलावा, प्रत्यक्ष reprogramming भी यानी इन कोशिकाओं को इस प्रकार के प्रत्यारोपण की जरूरत से परहेज की आवश्यकता होगी जहां अंग के भीतर, बगल में प्राप्त किया जा सकता है.
इसे ध्यान में रखते, हमारी प्रयोगशाला neurodegenerative रोगों के सेल आधारित चिकित्सा की दिशा में एक उपन्यास दृष्टिकोण के रूप में भारतीय नौसेना पोत में वंश reprogramming मस्तिष्क निवासी कोशिकाओं की संभावना का प्रयास किया है. संभावित वंश reprogramming के लिए सेलुलर लक्ष्य के रूप में माना जा सकता है कि ब्रेन निवासी कोशिकाओं अलग macroglia के प्रकार (astrocytes, NG2 कोशिकाओं और oligodendrocytes), microglia, और microvessel जुड़े कोशिकाओं (endothelial कोशिकाओं और pericytes) शामिल हैं. हम बड़े पैमाने पर मस्तिष्क भ्रष्टाचार के अस्थिकणिका की इन विट्रो reprogramming क्षमता का अध्ययन किया हैजल्दी प्रसव के बाद चूहों में 3-5 की टेक्स. वयस्क मानव मस्तिष्क में प्रत्यक्ष वंश reprogramming के लिए इसी तरह उपयुक्त सेल के सूत्रों की खोज में, हम सफलतापूर्वक आईएनएस और pericytes की प्रदर्शनी पहचान में reprogrammed किया जा सकता है कि एक सेल की आबादी का सामना करना पड़ा. यहाँ हम विस्तार और इन विट्रो में इन कोशिकाओं को समृद्ध, और अंततः सफलतापूर्वक में (25-30% की सीमा में) इन में इन विट्रो विस्तार कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा reprogram करने के लिए, वयस्क मानव मस्तिष्क की बायोप्सी से इन कोशिकाओं फसल के लिए की एक प्रोटोकॉल का वर्णन इन. Reprogramming दो प्रतिलेखन कारक, Sox2 और ascl1 के एक साथ रेट्रोवायरस की मध्यस्थता सह अभिव्यक्ति के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. ये PdiNs दोहराव कार्रवाई संभावित फायरिंग की क्षमता हासिल करने के लिए और तंत्रिका नेटवर्क में एकीकृत करने की उनकी क्षमता का संकेत अन्य न्यूरॉन्स के लिए के रूप में synaptic लक्ष्य की सेवा के लिए पाए गए. हमारे प्रोटोकॉल INS में वयस्क मानव मस्तिष्क pericytes का अलगाव और वंश रूपांतरण के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रदान करता है. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में इन विट्रो विस्तार और संवर्धन pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के वयस्क मानव मस्तिष्क प्रांतस्था से अलगाव के बाद और तंत्रिकाजन्य प्रतिलेखन के रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति द…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उसे इनपुट के लिए डॉ. मागदालेना Götz के लिए आभारी हैं. हम उदारता Sox2 कोडन अनुक्रम के साथ हमें प्रदान करने के लिए डा. मरियस Wernig (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी वायरस उत्पादन के लिए डॉ. एलेक्जेंड्रा Lepier के लिए बहुत आभारी हैं. यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 इ) और BMBF (01GN1009A) बी बी के लिए, और विज्ञान के Bavarian राज्य मंत्रालय, अनुसंधान और एम.के. और BBCs को कला Binational SYSTHER से प्राप्त धन का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया INREMOS वर्चुअल संस्थान (शिक्षा और अनुसंधान के जर्मन और स्लोवेनियाई संघीय मंत्रालयों) और DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
Referências
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