Burada sunulan tekniği özgürce tek dalga boyu maruz kullanılarak mikroskobik türler yüzme yolunu ölçer. C. elegans pahalı mikroskoplar için ucuz bir alternatif olarak gölge görüntüleme göstermek için kullanılır. Bu teknik yönü, hız, ivme ve güçlerini ölçmek için çeşitli yönelimleri, ortamları ve türler karşılamak için adapte edilebilir.
Bu çalışma, pozisyon, hız, ivme ve ışık tek dalga boyuna karşılık olarak su içinde süspansiyon haline getirilmiş bir sütun nematodların ettirici davranışı ile ilgili kuvvetleri gibi fiziksel özelliklerinin ölçümü sağlayan bir ucuz ve basit bir teknik gösterilmiştir. Biz iki farklı örnekler kullanarak Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme (SWSI) kullanılarak mikroskobik organizmanın lokomosyonu değerlendirmek nasıl gösterilmektedir.
İlk örnek C ortalama kökenli bir sistematik ve istatistiksel açıdan bir çalışmadır bir su sütununda elegans. Bu çalışma için, canlı ve ölü vahşitip C kullanılır biz yerçekimi alanındaki ölü solucanlar pasif iniş ile nematod aktif hareketin hızını ve yönünü karşılaştırıldığında elegans., bu çalışmada iniş-zamanlarda hiçbir fark olmadığını göstermiştir. Ortalama iniş tutarlı 633 nm kullanarak hem canlı hem ölü solucanlar için 0.1 mm / sn ± 1.5 mm / snışık.
İkinci örnek seçme bireysel C'lik bir vaka çalışması elegans dikey su kolonunda iniş sırasında yönünü değiştirerek. Hızlanma ve kuvvet bu örnekte analiz edilir. Bu vaka çalışması, geleneksel mikroskopları ile erişilebilir olmayan bir ortamda tek dalga boylarını kullanarak davranışlarını değerlendirirken Swsi kullanılarak değerlendirilebilir diğer fiziksel özelliklerinin kapsamını göstermektedir. Tek başına bir nematodu yaklaşık Bu analiz kullanılarak 28 nN aşan bir kuvvet ile agresif yeteneğine sahiptir.
Bulgularımız dönüm veya yerçekimi alanına karşı taşırken yaşayan nematod 28 NN uygulamak olduğunu göstermektedir. Bulgular ayrıca nematod pasif bir su sütunu iner öneririz, ancak aktif öncelikle yönünü çevirerek yerçekimi gücüne dayanabilecek.
Caenorhabditis elegans duyusal biyolojisi ve davranışları anlamak için son zamanlarda gen regülasyonu, kalkınma ve daha mekanizmaları çalışmak için güçlü bir model organizmadır bir serbest yaşayan faydalı toprak nematod olduğunu. Sadece 302 nöronlar, C olmasına rağmen elegans kompleks ettirici desenler, üreme davranışları, navigasyon, kemotaksi ve diğer davranışları yeteneğine sahiptir. C. elegans mekanoreseptörleri, kemoreseptörleri ve hatta mavi dalga boyundaki ışığın (Ward ve ark., 2008) 1. algılar sahip. Çok duyu ve motor fonksiyonda sinir devresi ve C genel ettirici desenleri hakkında bilinen iken elegans, daha az çoklu, eşzamanlı uyaranlara veya mikroskop altında örnek alınabilir daha karmaşık çevre koşullarına tepkileri hakkında bilinmektedir. Birkaç çalışmada yüksek plastik 2,3,4 daha da karmaşık ettirici desenleri ortaya koymuştur. Bizim metodolojik yaklaşım NEM çalışmalarını sağlayacakbunların da aynı anda birden fazla çevre koşulları sağlamak için, gerçek zamanlı olarak çözelti içinde atodes. Bu soru, geleneksel mikroskop tabanlı görüntüleme teknikleri kullanılarak ele zordur. Biz bize ettirici davranışlarını incelemek, hem de farklı çevre koşullarına yanıt lokomosyonu değiştirmek için nematod yeteneklerini belirlemek için bir su sütunu içinde nematod yerleştirmek için olanak sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdi.
Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme (SWSI) geleneksel mikroskoplar eksikliklerin giderilmesi için ilk kez bu yazıda sunulmaktadır. Geleneksel mikroskoplar derinliği 5,6 yatay bir odak düzlemi birkaç mikron türün gözlemlemek için sınırlıdır. Tek dalga boyu çalışmaları ile ilgili, en geleneksel mikroskoplar çok geniş, genellikle, 50-100 nm beyaz ışık süzmek için renk filtreleri kullanın. Işaret korurken SWSI için bir lazer kullanarak en az 1 nm dalga boyu seçimi daraltırificant ışık yoğunluğu 7. Benzer şekilde, tek bir dalga boyu C yüzme frekansları ölçmek için kullanılmıştır gerçek zamanlı 8 elegans.
Bizim yöntemin ilk gösterimi için, bir serbest yüzme C yatay konum, x, ve dikey konumu, y, monitör yaklaşık bir santimetre bir mesafede bir su sütununda elegans. Yerçekimi dikey olarak da hareket ettiği için, özellikle, dikey hareketi ilgilendi. Bu su sütununda iner gibi dikey konuma lineer uyum eğimi nematod düşey hız, v Y verir:
(1)
Kök ortalama hatası (RMSE) 9 kare uyum kalitesini gösterir ve azalan hızı genellikle sabit olup olmadığını gösterir. Dikey hızları daha sonra gereksinimleri için ortalaması alınırh türleri ve ölü solucanlar. Bu sonuçları kullanarak, solucanlar deneyim tahmin edilebilir sürükleyin.
Bizim yöntemin ikinci gösteri için, C seçili gözlenen solucanlar çoğunluğunun aksine sabit bir oranda alçalma vermedi elegans. Seçilen solucanlar etrafında döndü ve yukarı yüzerek veya iniş devam etmeden önce bir süre süpürdü ya. Fiziksel, bu vaka çalışması bir yüzme mikroorganizmanın itme hesaplanabilir olduğunu göstermektedir. Newton yasaları yön değiştiren bir vücut net bir kuvvet ima hızlandırır dikte, O vücutta 10 etkili olduğunu:
(2)
nerede olduğunuDoğrusal momentum ve t zamandır. Solucanın kütlesi sabit kaldığı için, solucanın ivme solucan üzerine etki eden kuvvet ile doğrudan orantılıdır. Bunun bir sonucu olarak, dikey net güçtür:
(3)
m bir solucanın kütlesi ve bir y ivmenin temsil eder. Dikey yönde net kuvvet daha sonra aynı yönde sonsuz itme temsil eder. Toplam itme hesaba yatay bileşeni alınarak hesaplanabilir.
SWSI tekniği serbest yaşayan nematod gibi mikroskobik organizmaların ettirici yeteneklerini anlamak için ek bir yol sağlar. Bu teknik sayesinde biz yerçekimi ölü nematod üzerinde çalışan aktif hareketlilik (yüzme) ve pasif sürüklenme arasında ayrım yapmak zorunda. Serbest yüzme nematodları suda hareket sırasında yönünü değiştirmek Buna ek olarak, biz nematod faaliyet ve nematod tarafından uygulanan olan sürükleme güçleri ve açısal kuvvetleri ölçebilir.
Nematodlar toprak içinde farklı çevresel koşullar karşılaşabilirsiniz. Su toprak içinde cepler, hem de katı parçacıklar ve farklı şekil ve dokular biyolojik malzeme vardır. Buna ek olarak, bunlar, 14 nematodlar yanıt bir çekim ortamı içinde mevcuttur. Ayrıca, toprağın yüzeyine yakın nematodlar farklı dalga boylarında ışık, sıcaklık ve nemde meydana gelen değişikliklerin yanı sıra maruz biyolojikbakteri, mantar ve diğer yırtıcı toprak organizmalar gibi değişkenler. Nematodlar, tüm bu farklı değişkenler yüzme ve farklı ortamlarda, emekleme, tornalama ve seyir stratejilerini değiştirerek yanıt vermek zorundadır. Bu karmaşık hesaplama tümü sadece 302 nöronlar, hareket içinde yer aldığı bir alt kümesi ve 95 vücut duvarı kas hücreleri tarafından gerçekleştirilmektedir. SWSI tekniği tarif tür ölçümler nematod bu seyir karmaşıklığı başarmak nasıl içine önemli bilgi sağlar.
Ilk bölümü için, biz yabanitip C genel azalan hızını ölçtük 633 nm ışık elegans. Bu ölçümleri kullanarak, sürükleme kuvveti bir solucan karşılaşır tahmin edebilirsiniz.
Bir hızlanan nematodun vaka çalışması için, kuvvetler hızı ile sürtünme kuvveti değişiklikleri beri sürekli bir değişim çıkıyor. Biz solucanın etkiyen kuvvetler hakkında yapabiliyorsunuz bazı ifadeler vardır. Solucan yavaşlar ve sw için çalışır gibiBu nematod'un yörünge düşük bir noktada sıfıra ulaşıncaya kadar im yukarı sürükleme kuvvetinin düşey bileşeni azalır. Bu noktada, solucan yüzmeye kadar yukarı doğru bir güce sahip olmalıdır.
Bu yöntem, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Berrak bir sıvı dolaşır herhangi mikroskobik türler Swsi kullanılarak izlenebilir. Çalışmalar dijital kameralar için erişilebilir herhangi bir dalga boyları ile yapılabilir. Dijital fotoğraf makineleri genellikle UV yakın IR dalgaboylarını almak olacaktır. Buna ek olarak, yatay çalışmalar dikey olarak yukarı lazer yönlendirilmesi ile gerçekleştirilebilir. Bu tür daha sonra bir mikroskoba gibi, yatay bir şeffaf yüzey üzerine yerleştirilebilir. Işın genişletici sonra ışın genişletici veya büyütücü lens ayarlayarak bulanık görüntüleri netleştirmek olabilir. Kullanıcı tutarlı ve kolay ışın uyum sağlamak için tabloya tüm bileşenleri tutturmak için emin olmalıdır.
Yöntem, uygun bir lazer wavelengt ile sınırlıdırhs ve çözünürlük. Kurulum basit olduğundan özünde yön ve dalga boylarında esneklik mevcut mikroskopları, üzerinde bu yöntemin avantajları da zayıflıkları vardır. Lazer içeriksiz optik ve benekler çözünürlüğünü sınırlamak. Bu sakıncaları bazıları kesinlikle uzaysal filtre içeren ve bir CCD kamera doğrudan görüntüsünü yansıtarak gelecekte gelişmiş olabilir.
Deney ilk defa yapıldığı gibi protokolde en kritik adımlar kolayca öğrenilebilir. Türbülans yaratmadan küvet içinde nematod yerleştirilmesi önemlidir. Ayrıca, titreşimler kurulum rahatsız ve solucanlar davranışını değiştirebilir. Görüntüyü gölge için kullanılan güç, sınırlamak için emin olun. Çapı 1 mm olan bir lazer ışın demeti boyunca 2 mW ısıtma etkileri önlemek için en fazla olmalıdır. Kurulum damıtılmış su haricindeki sıvıların kullanırken etkilerini saçılma için test edilmelidir.
Şu anda en çok microscopes dalga boyu aralığında hala çok geniştir beyaz ışık ya da renk filtreleri kullanarak yatay bir düzlemde çalışır. Gerçekten tek dalga boylarını kullanın ve görüntüleme senaryoda esneklik, yani yatay yerleşimini var mikroskoplar, genellikle bir avantaj veya diğer sınırlıdır. Ayrıca, mikroskoplar bu tür genellikle çok pahalı ve hala bizim yöntemin aksine odak düzlemleri ile sınırlıdır. Bizim kurulumu kolay son derece düşük bir bütçe ile inşa edilebilir. Bu yöntem, küçük finansmanı ile faaliyet okullarda, çevre şirketlerin yanı sıra diğer kuruluşlar tarafından kullanılmak üzere hazırdır. Gelecekte, bu yöntem hareketin ve mikroskopik türlerin mechanosensation gerçek zamanlı etkilerini incelemek amacıyla bir çok sofistike kurulumunda kullanılabilir. Bu yöntem, açıları ve kolayca kullanılabilir görüntüleme derinliklerde geniş bir dalga boyu aralığında bir yoğun çalışmalar yapmaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Biz Vassar Koleji Lisans Araştırma Yaz Enstitüsü (URSI), Lucy Maynard Salmon Araştırma Fonu, NASA ödül No NX09AU90A, Bilim ve Teknoloji (NSF-TEPE) Araştırma Mükemmellik Ulusal Bilim Vakfı Merkezi ödül No destek için minnettarız 0630388 ve NSF ödül No 1.058.385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |