여기에 제시된 기술은 자유롭게 단일 파장의 노출을 사용하여 미세한 종 수영의 경로를 측정한다. C. 엘레은 비용이 많이 드는 현미경에 저렴한 대안으로 그림자 영상을 보여주기 위해 사용된다. 이 기술은 방향, 속도, 가속도 및 힘을 측정하기 위하여 다양한 방향, 환경 및 종을 수용하도록 구성 될 수있다.
이 연구는 위치, 속도, 가속도와 빛의 단일 파장에 대한 응답으로 물기둥에 현탁 선충의 locomotory 행동에 관여 힘과 같은 물리적 특성의 측정을 수있는 저렴하고 간단한 기술을 보여줍니다. 우리는 두 가지 예를 이용하여 단일 파장 그림자 영상 (SWSI)를 사용하여 미세 유기체의 운동력을 평가하는 방법을 설명한다.
첫 번째 예는 C.의 평균 하강의 체계적이고 통계적으로 가능한 연구 결과입니다 물기둥의 엘레. 이 연구를 위해, 우리는 삶과 죽음 야생형 C를 사용 우리가 중력장 내에서 죽은 벌레의 수동 하강과 선충 활성 움직임의 속도와 방향을 비교했을 때 엘레.,이 연구는 하강 배의 차이를 보여 주었다. 평균 하강 일관된 파장 633 nm를 사용하여 두 라이브 죽은 벌레 0.1 mm / 초 ± 1.5 mm / 초였다빛.
두 번째 예는 일부 개별 C의 사례 연구입니다 엘레 수직 물기둥의 하강시 방향을 변경. 가속도와 힘이 예에서 분석된다. 이 사례 연구는 전통적인 현미경으로 액세스 할 수없는 환경에서 단일 파장을 사용하여 동작을 평가하는 동안 SWSI을 사용하여 평가 될 수있는 다른 물리적 특성의 범위를 보여준다. 우리가 각각의 선충을 잡은이 분석을 사용하여 28 윈 초과하는 힘으로 밀어 붙일 수있다.
우리의 연구 결과는 켜거나 중력장에 이동할 때 사는 선충 (28) 윈을 발휘 나타냅니다. 연구 결과는 또한 선충 수동적 물기둥에 내려하는 것이 좋습니다,하지만 적극적으로 주로 회전 방향으로 중력의 힘을 저항 할 수있다.
예쁜 꼬마 선충은 감각 생물학 및 행동을 이해하기위한 최근 유전자 조절, 개발 등의 메커니즘을 연구하기위한 강력한 모델 생물 인 독립 생활 유익한 토양 선충이다. 만 302 뉴런, C.에도 불구 엘레 복잡한 locomotory 패턴, 생식 행동, 탐색, 화성 및 다른 많은 행동 할 수있다. C. 엘레 기계적 수용기, chemoreceptors 심지어 빛의 파란색 파장 (구 등., 2008) 1 검출을 가지고있다. 대부분은 감각 기능의 신경 회로와 C. 일반 locomotory 패턴에 대한 알려져 있지만 엘레은 적은 여러 동시 자극이나 현미경으로 모델링 할 수있는 것보다 더 복잡한 환경 조건에 대한 응답에 대해 잘 알려져 있습니다. 몇 가지 연구는 매우 플라스틱 2,3,4 있습니다 더 복잡한 locomotory 패턴을 제시했습니다. 우리의 방법 론적 접근 방식은 NEM의 연구를 가능하게 할 것이다우리가 쉽게 동시에 여러 환경 조건을 제공 할 수있는 실시간 솔루션 atodes. 이 문제는, 종래의 현미경 이미징 기반 기법을 이용하여 해결하는 것이 어렵다. 우리는 우리가 locomotory 동작 검사뿐만 아니라, 다양한 환경 조건에 응답하여 운동을 변경하는 선충의 기능을 결정하기 위하여 수층 내의 선충을 배치 할 수 있도록 화상 기술을 개발했다.
단일 파장 그림자 영상 (SWSI)은 기존 현미경의 단점을 해결하기 위해 처음으로이 논문에서 제시된다. 기존의 현미경은 깊이 5,6에서 수평 초점면 몇 미크론에 종을 관찰 할 수 제한됩니다. 단파장 연구에 대하여, 가장 전통적인 현미경은 매우 광범위 전형적 50-100 nm의 백색광을 필터링하는 컬러 필터를 사용한다. 기호를 유지하면서 SWSI 위해 레이저를 사용하여 1 미만 nm의 파장 선택 좁아ificant 빛의 강도 7. 마찬가지로, 단일 파장의 C. 수영 주파수를 측정하기 위하여 사용되어왔다 실시간으로 8 엘레.
우리의 방법의 제 시연을 위해, 우리는 C. 자유롭게 수영의 수평 위치 x, 수직 위치 y를 모니터링 에 대한 센티미터의 거리에 물 열의 엘레. 중력은 또한 수직으로 작용 이후 특히, 수직 이동에 관심. 이 수층에 하강으로 수직으로 선형 피팅의 기울기는 선충류의 수직 속도 V의 Y를 준다 :
(1)
루트 의미 오류 (RMSE) 9의 광장은 적합의 품질을 표시하고 하강 속도는 일반적으로 일정한인지 여부를 나타냅니다. 수직 속도는 다음 EAC에 대한 평균을H 종과 죽은 벌레. 이러한 결과를 이용하여, 웜 경험이 추정 될 수 드래그.
우리의 방법의 두 번째 데모를 위해, 우리는 C를 선택 관찰 된 벌레의 대다수와는 달리 일정한 속도로 하강하지 않았다 엘레. 선택한 벌레는 돌아 서서 위쪽으로 수영이나 하강을 계속하기 전에 잠시 동안 공중 선회 하나. 물리적으로,이 사례 연구는 수영 미생물의 추력 계산 될 수 있음을 보여주고있다. 뉴턴의 법칙은 방향을 변경하는 몸이 순 힘을 의미하는 가속 것을 지시, 그 본체 (10)에 작용하는 것입니다 :
(2)
어디에 입니다선형 모멘텀 t는 시간이다. 웜의 질량은 일정하게 유지 이후 웜의 가속도가 웜에 작용하는 힘에 직접 비례한다. 결과적으로, 수직 총 힘이다 :
(3)
M은 웜의 질량이며, y는 수직 가속도를 나타냅니다. 수직 방향의 총 힘은 동일한 방향으로 웜 추력을 나타낸다. 전체 추력 고려 수평 성분을 취함으로써 계산 될 수있다.
SWSI 기술은 자유 생활 선충과 같은 미세한 미생물의 locomotory 기능을 이해하기 위해 또 다른 방법을 제공합니다. 이 기술로 우리는 중력이 죽은 선충에 운영을 활성화 운동 (수영) 및 수동 드리프트 사이에 구별했다. 자유 수영 선충 물에 운동하는 동안 방향을 변경하는 경우 또한, 우리는 선충에 운영 및 선충에 의해 작용하는 항력과 각도의 힘을 측정 할 수 있습니다.
선충은 토양 내의 다른 환경 조건을 발생합니다. 물 토양 내 주머니뿐만 아니라, 고체 입자와 다른 모양과 질감의 생물학적 물질이있다. 또, 선충들은 14에 응답 중력 환경에서 존재한다. 더욱이, 토양의 표면 근방 선충은 상이한 광 파장, 온도 및 습도의 변화뿐만 아니라 노출되는 생물학적박테리아, 약탈 버섯 및 기타 토양 생물과 같은 변수. 선충은, 모든 다른 변수에 수영과 다른 매체에 크롤링, 회전 및 탐색 전략을 변경을 응답해야합니다. 이러한 복잡한 계산 모두는 단지 302 뉴런, 운동에 관련되어있는 서브 세트 및 95 보디 벽 근육 세포에 의해 수행된다. SWSI 기술에 의해 기술 된 종류의 측정은 선충이 탐색 복잡성을 수행하는 방법에 중요한 통찰력을 제공합니다.
첫 번째 부분을 위해, 우리는 야생형 C.의 전체적인 하강 속도를 측정했다 633 nm의 빛 엘레. 이러한 측정을 사용하여, 우리는 항력에게 웜 만남을 추정 할 수있다.
가속 선충의 사례 연구, 힘 속도로 항력 변화하기 때문에 지속적으로 변화를하고있었습니다. 우리가 웜에 작용하는 힘에 대해 할 수있는 몇 가지 문이있다. 웜은 속도가 느려집니다 및 기타 sw하려고으로이 선충의 궤도의 낮은 지점에서 0에 도달 할 때까지 메신저 위쪽으로 드래그 힘의 수직 성분이 감소한다. 이 시점에서, 웜은 최대 수영을 상향 력이 있어야합니다.
이 방법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 투명한 액체에 탐색 모든 미세한 종 SWSI를 사용하여 추적 할 수 있습니다. 연구는 디지털 카메라에 액세스 할 수있는 모든 파장을 실시 할 수있다. 디지털 카메라는 일반적으로 자외선에서 근적외선에 이르는 파장을 데리러 것입니다. 또, 수평 연구는 수직 상방으로 레이저를 연출하여 수행 될 수있다. 종은 현미경 슬라이드와 마찬가지로 수평 투명한 표면 상에 배치 될 수있다. 빔 확장기 후 빔 확장기 또는 확대 렌즈를 조정하면 흐릿한 이미지를 선명하게 할 수 있습니다. 사용자가 일관성 있고 쉽게 빔 정렬을 보장하기 위해 테이블에 모든 구성 요소를 고정해야한다.
이 방법은 사용 가능한 레이저 wavelengt에 의해 제한된다HS 해상도. 설치가 간단하기 때문에 본질적으로 방향 및 파장의 유연성이다 기존의 현미경을 통해이 방법의 장점은 또한 단점입니다. 레이저의 단순한 광학 및 얼룩 해상도를 제한 할 수 있습니다. 이러한 단점의 일부가 확실하게 공간 필터를 포함하고 CCD 카메라에 직접 화상을 투영함으로써 미래에 개선 될 수있다.
실험이 처음으로 수행되는 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 쉽게 알게 할 수있다. 난류를 생성하지 않고 베트의 선충을 배치하는 것은 매우 중요합니다. 또한, 진동은 설치를 방해하고 웜의 동작을 변경할 수 있습니다. 이미지를 숨기는 데 사용되는 전원을 제한해야합니다. 직경 1mm 인 레이저 광에 대한 2 mW의 가열 효과를 피하기 위해 최대이어야한다. 설치는 증류수가 아닌 다른 액체를 사용하는 경우 산란 효과에 대한 검사를해야한다.
현재 대부분의 Microscopes은 파장 범위에 여전히 매우 광범위 흰색 조명이나 컬러 필터를 사용하여 수평면에서 작동합니다. 진정으로 하나의 파장을 사용하여 볼 시나리오의 유연성, 즉 수평 위치가 현미경은 일반적으로 하나의 장점 또는 다른 제한됩니다. 또한, 현미경의 이러한 유형은 일반적으로 매우 비싼 여전히 우리의 방법과는 달리 초점 비행기로 제한됩니다. 우리의 설치가 용이 매우 낮은 예산으로 구축 할 수 있습니다. 이 방법은 약간의 자금 운항 학교, 기업 환경뿐만 아니라, 다른 엔티티에 의해 사용될 준비이다. 장래에,이 방법은 운동력 현미경 종 mechanosensation 실시간으로 영향을 연구하기 위하여 매우 복잡한 설정에 사용될 수있다. 이 방법은 각도와 쉽게 사용할보기 깊이의 넓은 범위에서 단일 파장의 연구를합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 바 사르 대학 학부 연구 여름 연구소 (URSI), 루시 메이 너드 연어 연구 기금, NASA 보너스 번호 NX09AU90A, 과학 기술 (NSF-CREST)의 우수 연구에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 센터 보너스 번호의 지원에 대한 감사 0,630,388 및 NSF 보너스 번호 1,058,385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |