Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Alicia Jago; Tewa Kpulun; Kathleen M. Raley-Susman; Jenny Magnes

doi:10.3791/51424

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Engenharia

Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging Caenorhabditis elegans Locomotion einschließlich Kraft-Schätzungen

Published: April 18, 2014

doi:

10.3791/51424

Alicia Jago¹, Tewa Kpulun¹, Kathleen M. Raley-Susman², Jenny Magnes¹

¹Physics and Astronomy Department,Vassar College, ²Biology Department,Vassar College

Summary

Die hier vorgestellte Technik misst den Weg frei schwimmen mikroskopischen Spezies unter Verwendung einer einzigen Wellenlänge Exposition. C elegans verwendet werden, um Schattenabbildungs als kostengünstige Alternative zu kostspieligen Mikroskope demonstrieren. Diese Technik lässt sich an verschiedenen Orientierungen, Umgebungen und Arten aufzunehmen, um die Richtung, Geschwindigkeit, Beschleunigung und Kräfte zu messen.

Abstract

Diese Studie zeigt eine kostengünstige und einfache Technik, die die Messung der physikalischen Eigenschaften wie Position, Geschwindigkeit, Beschleunigung und Kräfte in der Bewegungsverhalten des Nematoden in einer Wassersäule, in Antwort auf einzelne Wellenlängen von Licht ausgesetzt beteiligt ermöglicht. Wir zeigen, wie die Fortbewegung eines mikroskopischen Organismus mit Einzel-Wellenlänge Schatten Imaging (SWSI) mit zwei verschiedenen Beispielen zu evaluieren.

Das erste Beispiel ist eine systematische und statistisch tragfähige Untersuchung der durchschnittlichen Abstieg C. elegans in einer Wassersäule. Für diese Studie, lebenden und toten Wildtyp-C verwendeten wir elegans. Beim Vergleich der Geschwindigkeit und Richtung der Nematoden aktive Bewegung mit dem passiven Abstieg des toten Würmer im Gravitationsfeld, zeigte diese Studie keinen Unterschied in der Abfahrt-Zeiten. Die durchschnittliche Abstieg war 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s sowohl für die lebenden und toten Würmer mit 633 nm kohärentenLicht.

Das zweite Beispiel ist eine Fallstudie von ausgewählten Einzel C. elegans Richtungswechsel beim Abstieg in einer vertikalen Wassersäule. Beschleunigung und Kraft werden in diesem Beispiel analysiert. Diese Fallstudie zeigt den Umfang der anderen physikalischen Eigenschaften, die mit SWSI bei der Auswertung des Verhaltens mit einzelnen Wellenlängen in einer Umgebung, die nicht zugänglich ist mit traditionellen Mikroskopen ausgewertet werden können. Mit dieser Analyse, die wir geschätzt, eine individuelle Nematoden der Lage ist, stieß mit einer Kraft von mehr als 28 nN.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Leben ausüben Nematoden 28 nN beim Drehen oder Verschieben gegen das Gravitationsfeld. Die Ergebnisse legen nahe, dass weitere Nematoden passiv Abstieg in einer Wassersäule, sondern kann die Schwerkraft aktiv Widerstand vor allem durch Drehrichtung.

Introduction

Caenorhabditis elegans ist ein frei lebende Nematoden, die nützlichen Boden ein leistungsfähiges Modellorganismus zur Untersuchung von Mechanismen der Genregulation, Entwicklung und vor kurzem für das Verständnis der sensorischen Biologie und Verhalten. Trotz nur 302 Neuronen, C. elegans sind zu komplexen Bewegungsmustern, Fortpflanzungsverhalten, Navigation, Chemotaxis und viele andere Verhaltensweisen. C elegans besitzen Mechanorezeptoren, Chemorezeptoren und sogar blauen Wellenlängen des Lichts (Ward et al., 2008) ¹ zu erfassen. Während viel über die neuronalen Schaltkreise der Sensomotorik und allgemeine Bewegungsmuster in C bekannt elegans, weniger ist über den Antworten auf mehrere, gleichzeitige Stimuli oder komplexer Umgebungsbedingungen, als sie unter einem Mikroskop abgebildet werden bekannt. Ein paar Studien haben komplexer Bewegungsmuster, die sehr plastische ^2,3,4 sind aufgedeckt. Unser methodischer Ansatz werden Studien von nem aktivierenatodes in Lösung in Echtzeit, wo wir ohne weiteres bieten mehrere Umweltbedingungen gleichzeitig. Diese Frage ist schwierig zu adressieren mit herkömmlichen Mikroskop-basierten bildgebenden Verfahren. Wir haben ein bildgebendes Verfahren, das uns Nematoden in einer Wassersäule platzieren, um Bewegungsverhalten zu untersuchen, sowie festzustellen, die Fähigkeiten von Nematoden Fortbewegung in Reaktion auf verschiedene Umweltbedingungen ändern können, entwickelt.

Single Wavelength Schatten Imaging (SWSI) wird in diesem Dokument zum ersten Mal, um die Mängel der herkömmlichen Mikroskopen Adresse dargestellt. Traditionelle Mikroskope sind beschränkt auf Arten in einer horizontalen Brennebene wenige Mikrometer in die Tiefe ^5,6 zu beobachten. In Bezug auf einzelne Wellenlänge Studien, die meisten traditionellen Mikroskopen Farbfilter, um weißes Licht sehr breit, typischerweise 50-100 nm filtern. Verwendung eines Lasers für SWSI engt die Auswahl der Wellenlänge von weniger als 1 nm, während Zeichenificant Lichtintensität ^7. Ebenso einzelnen Wellenlängen verwendet worden, um Schwimmen Frequenzen der C messen elegans in Echtzeit ^8.

Für die erste Demonstration der Methode, überwachen wir die horizontale Position x und die vertikale Position, y, einer frei schwimm C. elegans in einer Wassersäule, über eine Distanz von etwa einem Zentimeter. Insbesondere interessieren wir uns für die vertikale Bewegung, da die Schwerkraft wirkt auch vertikal. Die Steigung einer linearen Anpassung der vertikalen Position gibt die vertikale Geschwindigkeit, v _y, des Nematoden, wie es in der Wassersäule herab:
(1)

Der quadratische Mittelwert des Fehlers (RMSE) ⁹ zeigt die Qualität der Passform und zeigt an, ob die Abwärtsgeschwindigkeit in der Regel konstant ist. Die vertikalen Geschwindigkeiten werden dann für eac gemittelth Arten und tote Würmer. Mit Hilfe dieser Ergebnisse, die Gegenkraft, die die Würmer Erfahrung geschätzt werden kann.

Für die zweite Demonstration unserer Methode, C. wählten wir elegans, die nicht mit einer konstanten Rate herab hat im Gegensatz zu der Mehrheit der beobachteten Würmer. Die ausgewählten Würmer entweder drehte sich um und schwamm nach oben oder schwebte für eine Weile bevor der Abstieg. Physikalisch Diese Fallstudie zeigt, dass die Schubkraft eines Schwimmmikroorganismus kann berechnet werden. Newtons Gesetze schreiben vor, dass ein Körper, der Richtungen ändert beschleunigt, was eine Nettokraft impliziert, , Ist auf diesen Körper ¹⁰ wirkt:
(2)

wo istder lineare Impuls und t die Zeit ist. Die Beschleunigung der Schnecke ist direkt proportional zu der auf die Schnecke wirkt, da die Masse der Schnecke konstant bleibt. Als Ergebnis ist die vertikale Nettokraft:
(3)

wobei m die Masse der eine Schnecke und ein _y die vertikale Beschleunigung. Die Nettokraft in der vertikalen Richtung repräsentiert dann die Schubschnecke in der gleichen Richtung. Der Gesamtschub kann durch die horizontale Komponente berücksichtigt berechnet werden.

Protocol

1. C elegans Vorbereitung Bereiten Petrischalen der jungen Erwachsenen C. elegans als in früheren Experimenten mit Aussetzung der C beschrieben elegans in einem Fluid gefüllte Küvette 11. Am Tag der Video-Analyse, Pick Live jungen Erwachsenen Nematoden direkt in eine Küvette mit entionisiertem destilliertem Wasser mit einem Platin Pick, wie in Schritt 2 beschrieben gefüllt. Bereiten tot C. elegans mit Chloroform Exposition. Weiter mit dem Anschluss an die für die Kommissionierung in Schritt 2 beschrieben Live-Nematoden beschriebenen Verfahren. 2. Optischer Aufbau für die Videoanalyse Bauen Sie den Versuchsaufbau, um Schattenbilder, wie in Abbildung 1 gezeigt erstellen. Die Kamera kann in einem beliebigen Abstand vom Bildschirm, solange es in der Lage, eine Frontalansicht auf dem Bildschirm zu erfassen ist, platziert werden. Ein guter Platz ist neben der Küvette mit Blick auf den Bildschirm. Verwendung von wenigstens zwei Spiegelnsteuern der abstimmbaren Laserausgangs Helium-Neon in ein Galilei Strahlaufweiter, so dass der Strahl auf einen Durchmesser von 12 mm erweitert. Platzieren einer oder zwei Nadellöcher im Strahlengang, so daß der Strahl durch den Nadellöchern ohne Behinderung. Verwenden Sie die Nadelstiche, um sicherzustellen, die Ausrichtung wird beibehalten. Richten Sie den Strahl auf eine erweiterte montiert Quarzküvette, die 10 mm breit, 10 mm tief und 4 cm hoch ist. Vergrößern des Strahls unter Verwendung einer plankonvexen Linse mit einer positiven Brennweite von 75 mm. Legen Sie eine Projektionsleinwand ca. 120 cm von der Linse. Abstände größer als diese eine größere Vergrößerung des Schattenbildes zu erhalten. Allerdings wird die Qualität des Bildes mit einer geringeren Lichtstärke und eine erhöhte Wahrnehmbarkeit der Beugung Störungen zu verringern. Legen Sie ein High-Speed-Kamera, die in der Lage ist mindestens 60 fps ist, direkt neben der Küvette mit Blick auf den Bildschirm. Legen Sie ein Binokular in der Nähe des optischen Aufbausfür eine schnelle Übertragung von Nematoden in die Küvette. Vorübergehend zu sichern eine transparente Lineal mit mm Teilung zum Zentrum der Küvette Halter senkrecht zu der aufgeweitete Strahl, so dass der Strahl projiziert ein vergrßertes Bild des Lineals auf dem Bildschirm. Stellen Sie die Längenskala für die Videoanalyse. Auf der Leinwand, markieren Sie die Skalenabstand mit einem transparenten Herrscher aus der Mitte von dem projizierten Bild nicht zu stören mit der Projektion. Klicken Sie hier für Video. Nehmen Sie dieses Bild und messen Sie die Vergrößerung. Entfernen Sie die Herrscher aus dem Setup. Diesen Schritt für andere Wellenlängen als der Brechungswinkel des Lichts für jede Wellenlänge durch die Linse wird aufgrund der chromatischen Aberration variiert. Ersetzen Sie die Küvette und füllen Sie es innerhalb von 1 mm von der Felge mit destilliertem Wasser. Starten Sie die Aufnahme, während die Zimmer Licht an ist, so dass die Skala Abstand wird in der gleichen enthaltenAufnahmen wie die projizierte Bild. Schalten Sie das Licht aus. Mit einem dünnen, flachen Platindraht-Auswahl, Verschieben einzelner junger Erwachsener C. elegans eine zu einem Zeitpunkt von der Agarplatte in die Küvette durch Berühren der Auswahl, um die Oberfläche des Wassers. Die Nematoden werden sichtbar in der Wassersäule, wenn es in den Strahl durch Streulicht. Klicken Sie hier für Video. Film die projizierten Bilder der Würmer als sie durch den aufgeweiteten Laserstrahl passieren. Es ist wichtig zu beachten, dass das projizierte Bild umgekehrt wird und die Würmer scheinen in der entgegengesetzten Richtung der tatsächlichen Bewegung zu bewegen. Worms, die mit der Schwerkraft sind absteigend nach oben erscheint auf dem Bildschirm bewegen (Abbildung 2). 3. Video Data Preparation Importieren Sie das Video in der Videoanalyse-Programm. Stellen Sie die Waage mit dem Vergrößerungsfaktor vorher bestimmt. Track die lineare Verschiebung des Kopfes des schattierten Nematoden mit mindestens 10 Datenpunkte über den gesamten Weg gemacht. Findet die Geschwindigkeit in vertikaler Richtung, indem Derivat ("Y", "Zeit") und teilt diesen Wert durch den Vergrößerungsfaktor in Schritt 2.2 bestimmt. 4. Datenanalyse Analysieren Sie den linearen Abstieg eines C. elegans: Zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Datenpunkte in der vertikalen Position gegenüber der Zeit Graphen bilden im allgemeinen eine Gerade. Einige Abweichungen können durch die Kopfbewegung des Fadenwurms ignoriert. Wenn die Datenpunkte bilden in der Regel eine gerade Linie, fahren Sie mit Schritt 4.1.2, da sonst der Abstieg ist nicht linear und die Analyse sollte mit Schritt 5.1 in diesem Protokoll fortgesetzt werden. Erstellen Sie eine lineare Regressionslinie durch den Einbau einer geraden Linie 12 zu den Daten aus dem Menü Analyse. Die Steigung dieser Geraden ist dann die Vertikalgeschwindigkeit des C.elegans. Die Steigung ist die Positionsänderung geteilt durch die Änderung in der Zeit über ein bestimmtes Intervall. Bestimmen Sie die Abstiegsgeschwindigkeit der lebenden und toten Würmer in dieser Weise (Abbildung 3). Mittelwert der vertikalen Schwimmgeschwindigkeiten von den Nematoden. Eine Stichprobengröße von etwa 50 Würmer ausreichend. Vergleichen Schwimmgeschwindigkeiten im Live-Würmer mit Driftgeschwindigkeiten in toten Würmer. 5. Analysieren Nichtlineare Bewegung von C. elegans Aus § 3, wählen Sie eine Video-Datei analysiert, die eine nichtlineare Abstieg in der Wassersäule (Abbildung 4) zeigt. Eine nichtlineare Abstieg kann mit 4.1.1 Schritt in diesem Protokoll identifiziert werden. Wählen Sie "Curve Fit" von der "Analyse"-Menü in der Videoanalyse-Software. Wählen Sie einen zweiten Ordnung (quadratisch) Polynom. Setzen Sie die Kurve. Für eine Region von Interesse, den Sitz auf dem Graphen, indem die Klammern auf jeder Seite of die Passung auf der Kurve, bis die Kurve sehr nahe an der Datenpunkte in der Passform und / oder auch in den Fehlerbalken. Das Anpassungsprogramm gibt einen mathematischen Ausdruck für die angepasste Kurve, die vertikale Position gegen die Zeit ist. Betrachten Sie die angepasste Kurve Fehler, die durch das Programm mit den physikalischen Eigenschaften assoziiert gegeben. Einem relativen Fehler von 15% oder weniger ist in der Regel akzeptabel. Mehr hinzufügen Kurvenanpassungen, zusätzliche Datenabschnitte abzudecken. Spline 13 die Funktionen für die optimale Abdeckung: Stellen Sie sicher, dass die Kurve passt Überlappung und versuchen, benachbarte Kurven ausrichten, so dass die Pisten Spiel in den Überlappungsbereichen. Erhalten, die Geschwindigkeit für einen Bereich von Interesse, indem die Ableitung der angepassten Kurve mit der in Stufe 5.1.3 erhaltenen mathematischen Ausdruck. Geschwindigkeiten können in der Zeit variieren. Beachten Sie, dass das Derivat die Steigung einer Funktion. Das Derivat kann mathematisch oder graphisch erhalten werden. In diesem Fall ist es praktisch, den gegebenen mathematischen expr verwendenession. Nehmen Sie die zweite Ableitung der angepassten Kurven, um die Beschleunigung zu erhalten. Die Beschleunigung in der Zeit variieren. Multiplizieren Sie die Beschleunigung von dem Wurm Masse, um den Schub, die der Wurm übt berechnen. Eine vernünftige geschätzte Masse 3 ug davon aus, dass der Wurm besteht überwiegend aus Wasser.

Representative Results

Stetig Descent Die erste Untersuchung zeigt keine unterscheidbaren Unterschied in den absteigenden Raten der C elegans während SWSI mit 633 nm. Die absteigenden Raten wurden gefunden bei 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s sowohl für den Live-und der Toten C konstant zu sein elegans. Eine Stichprobengröße von 50 Würmer erzeugt eine angemessene Abweichung von 7% sowohl für die lebenden und toten Würmer. Es gibt keine Beschleunigung, die auf die Würmer, da die Abwärtsgeschwindigkeit konstant ist, so dass die Widerstandskraft entspricht der Gewichtskraft minus der Auftriebskraft. Dies bedeutet, dass die Dichte der Schnecke ist etwas größer als die von Wasser; jedoch für die Schätzungen darunter ist immer noch praktisch anzunehmen, dass die Dichte einer Nematode etwa die von Wasser. Richtungswechsel Die zweite Untersuchung, eine Fallstudie zeigt, dass Nematoden sind in der Lage, die Richtung ändern und gegen oben schwimmenSchwerkraft. Zwei Kurven wurden auf die vertikale Verschiebung des Nematoden versehen, so dass die zweiten Ableitungen von diesen Kurven können verkeilt, um die Beschleunigung als Funktion der Zeit (Fig. 5) anzuzeigen ist. Es ist ratsam, den Polynomordnung so gering wie möglich zu halten und gleichzeitig eine gute Passform. Eine niedrigere Polynomordnung zeigt weniger Variation in der Beschleunigung über die Zeit. Die höheren Polynom Begriffe vernachlässigbar und daher nicht notwendig sein, wenn die Ordnung des Polynoms ist zu hoch. Diese Schnecken verzögert mit einer konstanten Rate von 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / sec 2, dreht sich um und beschleunigt mit der gleichen Rate 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / sec 2 bis kurz nach der Wendepunkt. Die C. elegans weiterhin mit einer abnehmenden Beschleunigung der 1.252 nach oben bewegen – 0,00708 t in mm / s 2, bis die Beschleunigung auf Null fällt. Wenn man bedenkt, Gl. 3, und eine geschätzte Masse von 3 Wurm & #956, g, der Wurm erfährt eine vertikale Nettokraft, F Ny, von 0,33 pN, bis kurz nach dem Wendepunkt. Abstieg: Es gibt drei Arten von Kräften wirken auf die Schnecke, bis der Wurm den Wendepunkt erreicht: die Schwerkraft, Widerstand, Auftrieb und Schub (Abb. 6a). Die Nettokraft ist gleich der Vektorsumme der drei Kräfte. Wir betrachten hier nur die vertikalen Komponenten: Ny F = F + F Ty Dy-F + F g B (4) wobei F B ist die Auftriebskraft. F g ist in der Größe gleich, aber entgegengesetzt in Richtung der Auftriebskraft unter der Annahme, dass die Dichte der Schnecke ist die von Wasser. Gl. 4 kann dann in der folgenden Weise geschrieben werden: Ny F = F + F Ty Dy (5) F Ny bleibt während der Abfahrt konstant. Dies impliziert, dassF + F Ty Dy bleibt konstant, bis der Nematode den Turnaround Punkt erreicht. F Dy größten an der Spitze, die den Beginn des Pfades ist, und nach und nach auf Null reduziert ist, bis die Geschwindigkeit ist Null, während der Wendepunkt F Ty muss wachsen, um F Ny konstant zu halten. Turnaround: Es gibt kein Widerstandskraft in vertikaler Richtung an der Wendepunkt, da die vertikale Geschwindigkeit gleich Null ist an diesem Punkt. Die in vertikaler Richtung wirkenden Kräfte sind nur die Schwerkraft, – F g, Auftrieb, F B und der vertikale Schneckenschub Ty F, wie in Fig. 6b dargestellt. An diesem Punkt wird der Schub des C. elegans bestimmt werden: F = F Ty Ny (6) Der Schub an der Unterseite der Bahn wird dann etwa gleich 0,33 pN, die etwa 0,001% des Gewichts des Wurms ist. AngeKonto, das geschätzte Gewicht, F g eines C elegans ist 28 nN, Aufstieg: Auch während der Aufstieg, ziehen steigt aber nach unten zeigt (Abb. 6c): F Ny = Dy-F + F Ty (7) Die von dem Wurm implementiert Schub muss nun sogar noch größer sein, und gleich der Summe der Widerstandskraft und das Gewicht. Der Wurm verlangsamt sich nach Beginn um zu schwimmen. Um mit der gleichen Rate wie der Wurm stieg schwimmen, würde der Wurm müssen einen Aufwärtsschub von mindestens doppelt so schwer zu nehmen. Schwebend Ein Beispiel einer Schnecke, die seinen Abstieg für ca. 3 sec verlangsamt ist in Fig. 7 dargestellt. Ein Polynom 3. Grades ist eine vernünftige fit für die Gesamtstrecke. Die Fehler in der Beschleunigung und Geschwindigkeit aus dieser Anpassung sind weniger als 15%. Der Wurm startet mit einem deutlichen upward Schub, verlangsamt sich und beginnt, sich umzudrehen auf 68 Sek.; jedoch kontinuierlich sinkt die Beschleunigung nach oben (Fig. 8) bis der Netto Beschleunigung gleich Null ist rund 68,5 sek. Dies führt schließlich zu einer Gesamtbeschleunigung in der Richtung nach unten gefolgt von einer weiteren Nullpunkt der Geschwindigkeit (Fig. 9) und der Fadenwurm beginnt wieder bei 69 sec steigen. Es ist interessant zu beobachten, daß die maximale Vertikalbeschleunigung in diesem Fall 2,7 mm / sec 2. Die Beschleunigung an den Umkehrpunkten sind 0,455 mm / sec 2 und – 0,455 mm / sec 2 sind; etwa vier Mal größer als in dem Fall des Fadenwurms, der sich umdreht und schwimmt auf. Mit Gl. 6, kann abgeschätzt werden, dass die Aufwärtsschubkraft etwa 1,32 pN am ersten Wendepunkt. An der zweiten Wendepunkt, ist der Netto Beschleunigung negativ, so dass die Aufwärtsschub beträgt 1,32 pN. Abbildung 1. Versuchsaufbau. Die Laser, Strahlaufweitung, Objektiv und Bildschirm sind für den Versuchsaufbau. Steuerspiegel und Nadelstiche können weggelassen werden, jedoch wird die optische Ausrichtung weniger stabil machen. Abbildung 2. Einzel-Wellenlänge Schatten Bild (SWSI). Verwendung von 2 mW von 543 nm-Laserlicht der Schatten einer Schnecke auf eine Leinwand projiziert. Das Bild wird umgekehrt, so dass die Nematoden scheint nach oben zu fallen. 424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/> Abbildung 3. Höhenunter eines einzelnen Wildtyp C. elegans in einer Wassersäule. Dieser Fadenwurm wurde von 633 nm kohärentes Licht beschattet. Die Steigung der linearen Anpassung zeigt eine Abwärtsgeschwindigkeit von 1,09 mm / s ± 0,01 mm / sec. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Displacement Graph einer einzigen nach oben schwimmen Wildtyp C. elegans. Zwei Keil passt Spuren die Gesamtstrecke des Fadenwurms. Die zweite Ableitung des Sitzes ergibt die Beschleunigung. 0.110 mm: Die maximale Beschleunigung ist leicht von der ersten Passform bestimmt / Sec 2 ± 0,002 mm / s 2. Nur wenige Fehlerbalken dargestellt, so daß die Datenpunkte und die Passform sichtbar bleiben. Dieser Fadenwurm wurde von 633 nm kohärentes Licht beschattet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5. Beschleunigung Graph eines einzelnen Wildtyp C. elegans. Dieser Fadenwurm hält eine konstante Aufwärtsbeschleunigung von 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / sec 2 so dass es zu verlangsamen und dann nach oben bewegen. Kurz nach dem Wendepunkt die Beschleunigung stetig abnimmt und die Netto Beschleunigung verringert sich auf Null. g "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 6. Force-Diagramme für den Abstieg, Aufstieg und Wendepunkt. Auftrieb und Schwerkraft sind in Größe und in entgegengesetzter Richtung gleich, so dass die Wirkung dieser Kräfte sich gegenseitig aufheben. Sie sind daher nicht in diesen Diagrammen dargestellt. (A) Der Wurm ist mit Drag-and-Schub nach oben herab. (B) Der Wurm ist am Tiefpunkt der Flugbahn ohne Luftwiderstand. Thrust nach oben zeigt. (C) Die Schnecke ist mit nach unten ziehen, während Schub nach oben aufsteigend. "Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/> Abbildung 7. Displacement Graph der Einzel Schweben Nematoden. Die Schnecke verlangsamt sich und beginnt sich zu drehen um bei etwa 68 sec beginnt aber absteigend rund 69 sek. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. .. Abbildung 8 Acceleration Graphen einer einzigen schwebenden Nematoden Dieser Wurm beginnt mit einer Aufwärtsbeschleunigung von 2,7 mm / s 2, auf Null ab und hat schließlich eine Abwärtsbeschleunigung -. 2,6 mm / sec 2 Bitte klicken Sie hier, um eine größere vers ansehenIonen dieser Figur. Abbildung 9. Geschwindigkeitsdiagramm eines einzigen schwebenden Nematoden. Dieser Wurm zum Stillstand kommt, bei 68 sec und beginnt, nach oben fahren, verlangsamt und erreicht eine Geschwindigkeit von Null in vertikaler Richtung bei 69 sec, gefolgt von einem Abstieg. Bitte klicken Sie hier, um eine zu sehen Größere Version der Figur. Tabelle 1. Durchschnittsgeschwindigkeiten von N2 Abstieg C. elegans. Live 50 und 50 Tote sind Nematoden trwährend ihrer Abstammung acked. Die Durchschnittsgeschwindigkeit für die Abfahrten ist das gleiche für die Live-und die toten Würmer: 1,5 mm / s ± 0,1 mm / sec.

Discussion

Die SWSI Technik bietet eine zusätzliche Möglichkeit, die Bewegungsmöglichkeiten von mikroskopischen Organismen wie frei lebende Nematoden zu verstehen. Mit dieser Technik haben wir zwischen aktiven Fortbewegung (Schwimmen) und passiven Drift durch die Schwerkraft, die auf toten Nematoden aus. Darüber hinaus, wenn frei schwimm Nematoden Richtung ändern während der Fortbewegung im Wasser, sind wir in der Lage, die Widerstandskräfte und Drehkräfte, die auf die Nematoden in Betrieb sind und von den Nematoden ausgeübt messen.

Nematoden begegnen verschiedenen Umweltbedingungen im Boden. Es gibt Wassertaschen im Boden, sowie festen Teilchen und biologischen Materialien in verschiedenen Formen und Texturen. Darüber hinaus bestehen Nematoden in einem Gravitationsumgebung, die sie zu ¹⁴ reagieren. Ferner sind Nematoden nahe der Oberfläche des Bodens, um verschiedene Wellenlängen des Lichts, Änderungen der Temperatur und Feuchtigkeit, sowie ausgesetzt biologischeVariablen wie Bakterien, Pilze und andere räuberische Bodenorganismen. Nematoden muss auf all diese verschiedenen Variablen reagieren, schwimmen und kriechen in verschiedenen Medien, Drehen und Ändern von Navigationsstrategien. Alle diese komplexen Berechnungen werden nur 302 Neuronen, eine Teilmenge davon in Lokomotion involviert, und 95 Körperwand Muskelzellen durchgeführt. Messungen der durch SWSI Technik beschriebenen Art liefern wichtige Einblicke, wie Nematoden erfüllen diese Navigations Komplexität.

Für den ersten Teil haben wir die Gesamt absteigend Rate von Wildtyp-C gemessen elegans in 633-nm-Licht. Mit diesen Messungen können wir die Widerstandskraft schätzen, ein Wurm Begegnungen.

Für die Fallstudie eines Beschleunigungs Nematoden, die beteiligten Kräfte Wechsel kontinuierlich, da die Bremskraft ändert sich mit Geschwindigkeit. Es gibt einige Aussagen, die wir sind in der Lage, über die auf die Schnecke wirkenden Kräfte zu machen. Wie der Wurm verlangsamt und versucht, swim nach oben die vertikale Komponente der Widerstandskraft ab, bis er Null am Tiefpunkt des Fadenwurms Flugbahn erreicht. An diesem Punkt muss der Wurm eine Aufwärtskraft haben zu schwimmen.

Dieses Verfahren kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Alle mikroskopischen Arten, die in einer klaren Flüssigkeit navigiert kann mit SWSI verfolgt werden. Das Studium kann mit beliebigen Wellenlängen, die zugänglich für Digitalkameras durchgeführt werden. Digitalkameras werden in der Regel holen Wellenlängen von UV bis IR in der Nähe. Zusätzlich kann die horizontale Studien durch Richten des Lasers senkrecht nach oben geführt werden. Die Art kann dann auf einer horizontalen, transparenten Oberfläche, wie einem Objektträger angeordnet werden. Einstellen der Strahlaufweitung oder die Lupe, nachdem der Strahl-Expander können verschwommene Bilder zu schärfen. Der Anwender sollte sicherstellen, um alle Komponenten auf den Tisch zu befestigen, um konsistente und einfache Strahlausrichtung zu gewährleisten.

Das Verfahren ist durch verfügbare Laser wavelengt begrenzths und Auflösung. Im Wesentlichen die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber herkömmlichen Mikroskopen, die die Flexibilität in Richtung und Wellenlängen sind, sind auch Schwachstellen, da der Aufbau einfach ist. Die naiv-Optik und der Laser-Speckle begrenzen die Auflösung. Einige dieser Nachteile können sicherlich in der Zukunft, indem räumliche Filter und Projizieren des Bildes direkt auf einer CCD-Kamera verbessert.

Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll kann leicht erlernt als das Experiment zum ersten Mal durchgeführt werden. Platzierung des Fadenwurms in der Küvette, ohne Turbulenzen ist kritisch. Außerdem können Vibrationen der Einrichtung stören und das Verhalten der Würmer zu ändern. Achten Sie darauf, die Macht, die verwendet wird, um Bildschatten zu begrenzen. 2 mW für einen Laserstrahl, die mit 1 mm im Durchmesser ist, sollte die maximale Erwärmungseffekte zu vermeiden. Das Setup sollte für Streueffekte bei der Verwendung anderer als destilliertes Wasser Flüssigkeiten getestet werden.

Momentan werden die meisten microscopes arbeiten auf einer horizontalen Ebene unter Verwendung von weißem Licht-oder Farbfilter, die im Wellenlängenbereich immer noch sehr breit sind. Mikroskope, die wirklich verwenden einzelne Wellenlängen und haben Flexibilität in der Betrachtungs Szenario, dh horizontale Platzierung, sind in der Regel ein Vorteil oder der anderen beschränkt. Außerdem sind diese Arten von Mikroskopen der Regel sehr teuer und noch Brennebenen im Gegensatz zu unseren Verfahren beschränkt. Unser Setup kann leicht mit einem extrem niedrigen Budget gebaut werden. Diese Methode ist bereit, die von Schulen, Umweltunternehmen sowie anderer Unternehmen, die wenig Geld arbeiten verwendet werden. In Zukunft kann diese Methode in einem sehr anspruchsvollen Setup verwendet, um Echtzeit-Effekte auf Fortbewegung und Mechanosensation von mikroskopischen Spezies zu untersuchen. Dieses Verfahren macht einzigen Wellenlänge Studium an einer Vielzahl von Blickwinkeln und Tiefen leicht erhältlich.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar für die Unterstützung des Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Forschungsfonds, NASA-Auszeichnung Nr. NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) Nr. Auszeichnung 0630388 und der NSF preis Nr. 1058385.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander	Thorlabs	BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm	Thorlabs	LA1257

Referências

Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).
Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
Keller, H. E., Pawley, J. B. . Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. , (2011).
Demtröder, W. . Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , (2003).
Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).
Mood, A., Graybill, F., Boes, D. . Introduction to the Theory of Statistics. , (1974).
Taylor, J. R. . Classical Mechanics. , (2005).
Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
Bevington, P. R. . Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , (1969).
Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).
Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -. J., Zoval, J. V., O’Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genética. 177, 835-845 (2007).

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Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).