Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Alicia Jago; Tewa Kpulun; Kathleen M. Raley-Susman; Jenny Magnes

doi:10.3791/51424

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Engenharia

Enkele golflengte Shadow beeldvorming van Caenorhabditis elegans Locomotion Inclusief Force Schattingen

Published: April 18, 2014

doi:

10.3791/51424

Alicia Jago¹, Tewa Kpulun¹, Kathleen M. Raley-Susman², Jenny Magnes¹

¹Physics and Astronomy Department,Vassar College, ²Biology Department,Vassar College

Summary

De hier gepresenteerde techniek meet de weg van vrij zwemmen microscopische soorten enkelvoudige belichtingsgolflengte. C. elegans worden gebruikt om schaduw beeldvorming te tonen als een goedkoop alternatief voor dure microscopen. Deze techniek kan worden aangepast aan verschillende richtingen, omgevingen en soorten tegemoet richting, snelheid, versnelling en krachten meten.

Abstract

Deze studie toont een goedkope en eenvoudige techniek die de meting van fysische eigenschappen zoals positie, snelheid, versnelling en die betrokken bij het motorisch gedrag van nematoden gesuspendeerd in een kolom water in reactie op enkele golflengten van het licht mogelijk maakt. We laten zien hoe je de motoriek van een microscopisch organisme met behulp Een golflengte Shadow Imaging (SWSI) met behulp van twee verschillende voorbeelden te evalueren.

Het eerste voorbeeld is een systematisch en statistisch levensvatbare studie van de gemiddelde afdaling van C. elegans in een kolom van water. Voor deze studie gebruikten we levende en dode wild-type C. elegans. Als we vergeleken de snelheid en richting van nematoden actieve beweging met de passieve afdaling van dode wormen in het gravitatieveld Deze studie toonde geen verschil in afkomst maal. De gemiddelde daling was 1,5 mm / sec ± 0,1 mm / sec voor zowel de levende en dode wormen gebruik 633 nm coherentlicht.

Het tweede voorbeeld is een case study van geselecteerde individuele C. elegans van richting te veranderen tijdens de afdaling in een verticale waterkolom. Versnelling en kracht geanalyseerd in dit voorbeeld. Deze case studie toont de werkingssfeer van andere fysische eigenschappen die kunnen worden geëvalueerd met behulp van SWSI terwijl de evaluatie van het gedrag met behulp van enkele golflengten in een omgeving die niet toegankelijk is met de traditionele microscopen. Met deze analyse schatten we individuele nematode kan duwen met een kracht van meer dan 28 nN.

Onze bevindingen wijzen erop dat vrijlevende aaltjes uitoefenen 28 nN bij het draaien of bewegen tegen het zwaartekrachtveld. De bevindingen suggereren verder dat nematoden passief afdalen in een kolom van water, maar kan actief verzetten tegen de zwaartekracht in de eerste plaats door richting te draaien.

Introduction

Caenorhabditis elegans is een vrijlevende gunstig bodemnematode dat is een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van genregulatie, ontwikkeling en meer recent voor het begrijpen van zintuiglijke biologie en gedrag. Ondanks het feit dat slechts 302 neuronen, C. elegans kunnen complexe motorische patronen, reproductieve gedrag, navigatie, chemotaxis en vele andere gedragingen. C. elegans bezitten mechanoreceptoren, chemoreceptors en zelfs blauwe golflengten van het licht (Ward et al.., 2008) ¹ op te sporen. Hoewel veel bekend is over de neurale circuits van sensomotorische functie en algemene motorische patronen in C. elegans, minder bekend over de reacties op meerdere, gelijktijdige stimuli of meer complexe omgevingsomstandigheden dan kan worden gemodelleerd onder een microscoop. Een aantal studies hebben meer complexe motorische patronen die sterk plastic ^2,3,4 onthuld. Onze methodologische aanpak zal studies van nem staatatodes in oplossing in real time waar we gemakkelijk kunnen bieden meerdere omgevingsfactoren tegelijk. Deze vraag is moeilijk aan te pakken met behulp van conventionele-microscoop gebaseerde beeldvormende technieken. We hebben een beeldvormende techniek die ons toelaat om nematoden te plaatsen binnen een kolom water om motorische gedrag te onderzoeken, evenals het bepalen van de mogelijkheden van nematoden tot voortbeweging veranderen als reactie op verschillende milieu-omstandigheden ontwikkeld.

Enkele golflengte Shadow Imaging (SWSI) wordt in dit document voor de eerste keer om de tekortkomingen van de traditionele microscopen pakken. Traditionele microscopen zijn beperkt tot soorten observeren in een horizontale focal plane enkele microns in de diepte ^5,6. Ten aanzien van enkele golflengte studies, de meeste traditionele microscopen gebruiken kleurfilters om wit licht zeer breed, meestal, 50-100 nm filteren. Met behulp van een laser voor SWSI vernauwt de golflengtekeuze minder dan 1 nm behoud tekenificant lichtintensiteit ^7. Zo hebben enkele golflengten gebruikt om te zwemmen frequenties van C. meten elegans in real time ^8.

Voor de eerste demonstratie van onze werkwijze controleren we de horizontale positie, x, en de verticale positie, y, van een vrij zwemmende C. elegans in een waterkolom, over een afstand van ongeveer een centimeter. In het bijzonder zijn we geïnteresseerd in de verticale beweging sinds de zwaartekracht werkt ook verticaal. De helling van een lineaire aanpassing van de verticale positie geeft de verticale snelheid, v _y, van de nematode die uitkomt in de waterkolom:
(1)

Het kwadratisch gemiddelde van de fout (RMSE) ⁹ geeft de kwaliteit van de pasvorm en geeft aan of de daalsnelheid is over het algemeen constant. De verticale snelheden worden dan gemiddeld voor each soorten en dode wormen. Met deze resultaten, de weerstand, die de wormen ervaring kan worden geschat.

Voor de tweede demonstratie van onze methode, we C. geselecteerd elegans die niet dalen met een constante snelheid in tegenstelling tot de meerderheid van de waargenomen wormen. De geselecteerde wormen ofwel draaide zich om en zwom naar boven of zweefde een tijdje voordat u verder de afdaling. Fysiek, deze case studie toont aan dat de strekking van een zwembad op het micro-organisme kan worden berekend. Wetten van Newton dicteren dat een lichaam dat richting verandert versnelt, hetgeen een netto kracht inhoudt, , Is die op dat lichaam ^10:
(2)

waar isde impuls en t de tijd. De versnelling van de worm is recht evenredig met de kracht die op de worm aangezien de massa van de worm constant blijft. Dientengevolge, de verticale netto kracht is:
(3)

waarbij m de massa van een worm en _y de verticale versnelling. De netto kracht in verticale richting vertegenwoordigt dan de worm stuwkracht in dezelfde richting. De totale stuwkracht wordt berekend door de horizontale component rekening.

Protocol

1. C. elegans Voorbereiding Bereid petri platen van jonge volwassen C. elegans zoals in eerdere experimenten met opschorting van C. elegans in een vloeistof gevulde cuvette 11. Op de dag van de video-analyse, pick levend jong volwassen aaltjes direct in een cuvet gevuld met gedeïoniseerd, gedestilleerd water met behulp van een platina pick zoals beschreven in stap 2. Bereid dood C. elegans met blootstelling chloroform. Ga door de beschreven voor het plukken levende nematoden in stap 2 beschreven procedure. 2. Optische Setup voor de Video Analysis Monteer de experimentele opstelling om schaduwbeelden te creëren zoals getoond in Figuur 1. De camera kan op een willekeurige afstand van het scherm zolang het in staat is een vooraanzicht van het scherm vast te leggen. Een goede plaats is naast de cuvet voor het scherm. Ten minste twee spiegelssturen de afstembare Helium-Neon laser-uitgang in een Galileeër bundelexpander dat de balk wordt uitgebreid met een diameter van 12 mm. Plaats een of twee gaatjes in de bundel pad, zodat de bundel gaat door de gaatjes zonder te worden belemmerd. Gebruik de gaatjes om ervoor te zorgen de uitlijning wordt gehandhaafd. Richt de uitgebreide bundel op een gemonteerde kwartscuvet dat is 10 mm breed, 10 mm diep en 4 cm hoog. Vergroot de straal met een plano-convexe lens met een positieve brandpuntsafstand van 75 mm. Plaats een projectiescherm ongeveer 120 cm van de lens. Afstanden groter dan dit zal een sterkere vergroting van het beeld de schaduw opleveren. Echter, de beeldkwaliteit afneemt met een lagere lichtintensiteit en een verhoogde merkbaarheidsvereiste van diffractie interferentie. Plaats een high-speed camera, die in staat is om ten minste 60 fps, direct naast de cuvette voor het scherm. Plaats een dissectiemicroscoop buurt van de optische setvoor snelle overdracht van nematoden in de cuvet. Tijdelijk verzekeren van een transparante liniaal met mm afdelingen naar het centrum van de cuvettehouder loodrecht op de geëxpandeerde bundel zodat de laserbundel projecteert een vergroot beeld van de liniaal op het scherm. Stel de lengte-schaal voor video-analyse. Op het projectiescherm, markeer de schaal afstand met behulp van een transparante liniaal uit het midden van het geprojecteerde beeld om te voorkomen dat interferentie met de projectie. Klik hier voor de video. Noteer deze afbeelding en meet de vergroting. Verwijder de heerser van de setup. Herhaal deze stap voor andere golflengten als de hoek van breking van licht voor elke golflengte door de lens zal variëren als gevolg van chromatische aberraties. Vervang de cuvet en vul het tot op 1 mm van de velg met gedestilleerd water. Begin met opnemen terwijl de kamer licht is, zodat de schaal afstand is opgenomen in dezelfdebeelden als het geprojecteerde beeld. Doe het licht uit. Met behulp van een dunne, platte platinadraad pick, verplaatsen individuele jonge volwassen C. elegans een voor een uit de agarplaat in de cuvet door op de oogst op het oppervlak van het water. De nematode zal zichtbaar worden in de waterkolom wanneer het in de bundel als gevolg van strooilicht. Klik hier voor de video. Film de geprojecteerde beelden van de wormen als ze door de geëxpandeerde laserbundel. Het is belangrijk op te merken dat het geprojecteerde beeld wordt omgekeerd en de wormen zullen lijken te bewegen in de tegenovergestelde richting van de werkelijke beweging. Wormen die zijn aflopende met de zwaartekracht zal verschijnen om naar boven op het scherm (figuur 2). 3. Video gegevens Voorbereiding De video te importeren in de video-analyse programma. Zet de schaal met de vergrotingsfactor eerder bepaald. Track de lineaire verplaatsing van het hoofd van de schaduw nematode met ten minste 10 meetpunten over het gehele weg genomen. Vind de snelheid in de verticale richting door middel derivaat ("Y", "Time") en verdeel deze waarde met de vergrotingsfactor bepaald in stap 2.2. 4. Data Analysis Analyseer de lineaire afdaling van een C. elegans: Controleer of de gegevenspunten in de verticale positie tijdgrafiek algemeen een rechte lijn. Sommige afwijkingen kunnen worden genegeerd door de hoofdbeweging van de nematode. Als de gegevens punten vormen in het algemeen een rechte lijn, verder met stap 4.1.2, anders wordt de afdaling is niet-lineaire en de analyse moet worden voortgezet met behulp van stap 5.1 in dit protocol. Maak een lineaire regressielijn door het aanbrengen van een rechte lijn 12 om de gegevens van het menu Analyse. De helling van deze lijn is dan de verticale snelheid van de C.elegans. De helling is de verandering in positie gedeeld door de verandering in de tijd op een bepaald interval. Bepaal de daalsnelheid van de levende en dode wormen op deze wijze (figuur 3). Het gemiddelde van de verticale zwemmen snelheden van de nematoden. Een steekproef van ongeveer 50 wormen is voldoende. Vergelijk zwemmen snelheden in levende wormen met drift snelheden in dode wormen. 5. Analyseer lineaire beweging van C. elegans Uit hoofdstuk 3, selecteer een geanalyseerd videobestand, die een niet-lineaire afdaling in de waterkolom (figuur 4) toont. Een niet-lineaire afdaling kan worden geïdentificeerd met behulp van stap 4.1.1 in dit protocol. Selecteer 'Curve Fit' in het menu 'Analyse' in de video analyse software. Selecteer een tweede orde (kwadratisch) polynoom. De ronding. Voor een regio van belang, passen de pasvorm op de grafiek door te schuiven de beugels aan beide zijden of de pasvorm in de grafiek totdat de kromme vlakbij de gegevenspunten binnen de pasvorm en / of ruim binnen de foutbalken. De fitting programma geeft een wiskundige uitdrukking voor de gemonteerde curve, die is verticale positie tegen de tijd. Denk aan de ingebouwde curve fouten gegeven door het programma in verband met de fysische eigenschappen. Een relatieve fout van 15% of minder is meestal aanvaardbaar. Voeg meer curve past om extra delen van gegevens te dekken. Spline 13 de functies voor optimale dekking: zorg ervoor dat de curve past overlap en probeer aangrenzende bochten af te stemmen, zodat de hellingen wedstrijd in de overlappende gebieden. Het verkrijgen van de snelheid voor een regio van belang door het nemen van de afgeleide van de ingebouwde curve met behulp van de wiskundige uitdrukking verkregen in stap 5.1.3. Snelheden kunnen variëren in de tijd. Merk op dat het derivaat de helling van een functie. Het derivaat kan mathematisch of grafisch worden verkregen. In dit geval is het praktisch om de opgegeven wiskundige expr gebruikensessieschijven. Neem de tweede afgeleide van de gemonteerde bochten om de versnelling te krijgen. De versnelling kan variëren in de tijd. Vermenigvuldig de versnelling door de worm massa om de stuwkracht, die de worm uitoefent berekenen. Een redelijke geschatte massa is 3 pg veronderstelling dat de worm bestaat grotendeels uit water.

Representative Results

Steady Descent Het eerste onderzoek blijkt geen verschil te onderscheiden in de dalende tarieven van de C. elegans tijdens SWSI behulp van 633 nm. De dalende prijzen bleken constant te zijn op 1,5 mm / sec ± 0,1 mm / sec voor zowel de live als de doden C. elegans. Een steekproef van 50 wormen genereerde een redelijk verschil van 7% voor zowel levende als dode wormen. Er is geen versnelling die op de wormen aangezien de daalsnelheid constant is, zodat de wrijvingskracht gelijk aan de zwaartekracht minus de opwaartse kracht. Dit betekent dat de dichtheid van de worm is iets groter dan die van water; Voor de schattingen daaronder nog praktisch te veronderstellen dat de dichtheid van een nematode is ongeveer die van water. Veranderen van richting Het tweede onderzoek, een case study, toont aan dat nematoden zijn in staat om van richting te veranderen en kan naar boven zwemmen tegenzwaartekracht. Twee curven werden gemonteerd op de verticale verplaatsing van de nematode, zodat de tweede afgeleide van deze krommen kunnen worden splined versnelling tegen de tijd (Figuur 5) plotten. Het is raadzaam de orde polynoom zo laag mogelijk te houden terwijl er een goede pasvorm. Een lagere polynoom de volgorde geeft minder variatie in de versnelling in de tijd. De hogere orde polynoom termen verwaarloosbaar en dus niet nodig zijn als de graad van de polynoom te hoog. Deze worm vertraagt met een constante snelheid van 0.110 mm / sec 2 ± 0.002 mm / sec 2, draait zich om en versnelt tegen hetzelfde tarief 0,110 mm / sec 2 ± 0.002 mm / sec 2 tot kort na het omkeerpunt. De C. elegans blijft omhoog bewegen met een afnemende versnelling van 1,252-,00708 t mm / sec 2 tot versnelling daalt tot nul. Met in het achterhoofd Eq. 3, en een geschatte worm massa van 3 & #956, g, de worm ondergaat een verticale netto kracht, F Ny, van 0,33 pN tot kort na het omkeerpunt. Descent: Er zijn drie soorten krachten die op de worm tot de worm de ommekeer punt bereikt: de zwaartekracht, drag, drijfvermogen en stuwkracht (figuur 6a). De netto kracht is gelijk aan de vector som van alle drie krachten. Hier beschouwen we alleen de verticale componenten: F Ny = F Dy + F Ty-F g + F B (4) waar F B is de opwaartse kracht. F g gelijk in grootte maar tegengesteld in richting van de opwaartse kracht aangenomen dat de dichtheid van de worm is die van water. Eq. 4 kan dan worden geschreven op de volgende manier: F Ny = F Dy + F Ty (5) F Ny constant blijft tijdens de afdaling. Dit betekent datF Dy + F Ty blijft constant totdat de nematode de ommekeer punt bereikt. F Dy is grootst bij de top, die het begin van het pad, en geleidelijk vermindert tot nul totdat de snelheid nul is op het omkeerpunt terwijl F Ty moet toenemen tot F Ny constant te houden. Turnaround: Er is geen wrijving in de verticale richting op het omslag punt, aangezien de verticale snelheid gelijk aan nul op dat punt. De enige krachten die in verticale richting zijn zwaartekracht, – F g, drijfvermogen, F B en verticale worm stuwkracht F Ty, zoals afgebeeld in figuur 6b. Op dit punt, de strekking van de C. elegans kan worden bepaald: F Ty = F Ny (6) De stuwkracht onderin het traject is dan ongeveer gelijk aan 0,33 pN, ongeveer 0,001% van het gewicht van de worm. Rekening houdendacht de geschatte gewicht, F g van een C. elegans is 28 nN, Stijgen: Ook tijdens de opstijging, drag toeneemt, maar is naar beneden gericht (Figuur 6c): F Ny =-F Dy + F Ty (7) De door de worm stuwkracht moet nu nog groter zijn en gelijk aan de som van de wrijvingskracht en het gewicht. De worm vertraagt na beginnen te zwemmen. Om omhoog te zwemmen in hetzelfde tempo als de worm afstammen, zou de worm moeten een opwaartse stuwkracht van ten minste tweemaal zijn gewicht uit te oefenen. Zweven Een voorbeeld van een worm die zijn afdaling ongeveer 3 seconden vertraagt wordt getoond in Figuur 7. Een 3e polynoom is een redelijk geschikt voor de algemene weg. De fouten in de versnelling en de snelheid van deze fit minder dan 15%. De worm begint met een aanzienlijke upward stuwkracht, vertraagt en begint rond in 68 sec draaien; De opwaartse versnelling continu afneemt (fig. 8) totdat de netto versnelling gelijk aan nul rond 68,5 sec. Dit leidt uiteindelijk tot een netto versnelling in neerwaartse richting gevolgd door een nulpunt in de snelheid (figuur 9) en de nematode weer begint te dalen op 69 sec. Het is interessant dat de maximale waargenomen verticale versnelling in dit geval 2,7 mm / sec 2. De versnelling van de keerpunten zijn 0.455 mm / sec 2 en – 0,455 mm / sec respectievelijk 2; ongeveer vier keer groter dan bij de nematode die rond draait en zwemt. Met Eq. 6, kan worden geschat dat de opwaartse kracht is ongeveer 1.32 pN bij het eerste keerpunt. Bij het tweede keerpunt, de netto versnelling negatief is, zodat de opwaartse kracht is 1.32 pN. Figuur 1. Experimentele opstelling. De laser, beam expander, de lens en het scherm zijn essentieel voor de experimentele opstelling. De besturing spiegels en gaatjes kunnen worden weggelaten, maar zal de optische uitlijning minder stabiel maken. Figuur 2. Een golflengte Shadow Afbeelding (SWSI). Met behulp van 2 mW 543 nm laserlicht de schaduw van een worm wordt geprojecteerd op een scherm. Het beeld wordt omgekeerd zodat de nematode lijkt omhoog vallen. 424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/> Figuur 3. Verticale afdaling van een wild-type C. elegans in een waterkolom. Deze nematode werd overschaduwd door 633 nm coherent licht. De helling van de lineaire fit geeft een neerwaartse snelheid van 1,09 mm / sec ± 0,01 mm / sec. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4. Verplaatsing grafiek van een opwaartse zwemmen wild-type C. elegans. Twee gegroefde past traceren van de algemene pad van de nematode. De tweede afgeleide van de passing onthult de versnelling. De maximale versnelling kan eenvoudig bepaald worden uit de eerste aanpassing: 0.110 mm / Sec 2 ± 0.002 mm / sec 2. Slechts enkele fout bars zijn getoond, zodat de datapunten en de pasvorm zichtbaar blijven. Deze nematode werd overschaduwd door 633 nm coherent licht. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur. Versnelling 5 grafiek van een wild-type C. elegans. Dit aaltje zorgt voor een constante opwaartse versnelling van 0.110 mm / sec 2 ± 0.002 mm / sec 2 waardoor het vertragen en dan naar boven te bewegen. Kort na het omkeerpunt de versnelling vermindert gestaag en de netto versnelling afneemt tot nul. g "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6. Force diagrammen voor afdaling, punt en beklimming. Drijfvermogen en de zwaartekracht draaien zijn gelijk in grootte en tegengestelde richting zodat het effect van deze krachten elkaar opheffen. Ze worden dan ook niet weergegeven in deze diagrammen. (A) De worm is dalende met drag en duw naar boven. (B) De worm is op het laagste punt van het traject zonder slepen. Stuwkracht omhoog wijst. (C) De worm is oplopend met drag naar beneden terwijl de stuwkracht omhoog wijst. "Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/> Figuur 7. Verplaatsing grafiek van enkele zweven nematode. De worm vertraagt en begint rond op ongeveer 68 sec draaien maar begint aflopend ongeveer 69 sec. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. .. Figuur 8 Versnelling grafiek van een enkele zwevende nematode worm Dit begint met een opwaartse versnelling van 2,7 mm / sec 2, afneemt tot nul en heeft uiteindelijk een neerwaartse versnelling van -. 2.6 mm / sec 2 Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer. Figuur 9. Velocity grafiek van een enkele zwevende nematode. Deze worm komt tot stilstand op 68 sec en begint te boven het hoofd, vertraagt en snelheid nul in de verticale richting op 69 seconden gevolgd door een afdaling bereikt. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur. Tabel 1. Gemiddeld afdaling snelheden van N2 C. elegans. 50 levende en 50 dode nematoden zijn tracked tijdens hun afdaling. De gemiddelde snelheid van de afdalingen is hetzelfde voor de live en de dode wormen: 1,5 mm / sec ± 0,1 mm / sec.

Discussion

De SWSI techniek biedt een extra manier om de motorische mogelijkheden van microscopische organismen zoals vrijlevende aaltjes begrijpen. Met deze techniek hebben we onderscheid gemaakt tussen actieve motoriek (zwemmen) en passieve drift door de zwaartekracht die op dode nematoden. Bovendien, als vrij zwemmende aaltjes richting veranderen gedurende beweging in het water, zijn we in staat om de drag krachten en hoekige krachten, die actief zijn op de nematoden en uitgeoefend door de nematoden te meten.

Nematoden tegenkomen verschillende milieu-omstandigheden in de bodem. Er zijn waterzakken in bodem, en vaste deeltjes en biologische materialen van verschillende vormen en structuren. Bovendien nematoden aanwezig in een zwaartekracht milieu die reageren ^14. Verder nematoden nabij het oppervlak van de bodem worden blootgesteld aan verschillende golflengten van licht, veranderingen in temperatuur en vochtigheid, evenals biologischvariabelen zoals bacteriën, schimmels en andere roofzuchtige bodemorganismen. Nematoden moeten reageren op al deze verschillende variabelen, zwemmen en kruipen in verschillende media, draaien en veranderen van navigatie strategieën. Al deze complexe berekeningen worden uitgevoerd door slechts 302 neuronen, een subset van die betrokken zijn bij de voortbeweging en 95 lichaamswand spiercellen uitgevoerd. Metingen van de door SWSI techniek soort bieden belangrijke inzicht in hoe nematoden dit te bereiken navigatie complexiteit.

Voor het eerste deel hebben we de algemene dalende koers van wild-type C. gemeten elegans in 633 nm licht. Met behulp van deze metingen, kunnen we schatten de wrijvingskracht een worm ontmoetingen.

Voor de case study van een versnellende nematode, die betrokken zijn de krachten veranderen voortdurend omdat de wrijvingskracht verandert met de snelheid. Er zijn een aantal uitspraken die we in staat zijn om over de krachten die op de worm. Als de worm vertraagt en probeert swim boven de verticale component van de wrijvingskracht af totdat deze nul bereikt op het laagste punt van de baan van de nematode. Op dit punt moet de worm een opwaartse kracht moeten zwemmen.

Deze werkwijze kan worden gemodificeerd op verschillende manieren. Elke microscopische soorten die navigeert in een heldere vloeistof kan worden gevolgd met behulp van SWSI. Onderzoeken kunnen worden uitgevoerd met elke golflengte die toegankelijk zijn voor digitale camera's. Digitale camera's zal doorgaans halen golflengtes variërend van de UV tot nabije IR. Bovendien kan horizontaal studies worden uitgevoerd door het richten van de laser verticaal omhoog. De soort kan vervolgens op een horizontale transparante oppervlak worden geplaatst, zoals een microscoop dia. Het aanpassen van de lichtbundel expander of het vergrootglas na de bundel uitbreiding kan verscherpen onscherpe beelden. De gebruiker moet er zeker van om alle onderdelen te bevestigen aan de tafel om consistente en makkelijk koplampen zorgen.

Deze methode wordt beperkt door de beschikbare laser wavelengths en resolutie. In wezen de voordelen van deze methode ten opzichte van bestaande microscopen, die de flexibiliteit richtingen en golflengten zijn ook zwakke aangezien de installatie is eenvoudig. De onbedorven optica en spikkels van de laser beperken de resolutie. Sommige van deze nadelen kan zeker worden verbeterd in de toekomst door het opnemen ruimtelijk filter en het beeld projecteren direct op een CCD-camera.

De meest kritische stappen in het protocol kan gemakkelijk worden geleerd als het experiment wordt uitgevoerd voor de eerste keer. Het plaatsen van de nematode in de cuvette zonder dat er turbulentie is kritisch. Ook kan de installatie trillingen verstoren en het gedrag van de wormen veranderen. Zorg ervoor dat de stroom, die wordt gebruikt afbeelding om schaduw te beperken. 2 mW een laserbundel die 1 mm in diameter moeten de maximale verwarming effecten voorkomen. De setup moeten worden getest op verstrooiingseffecten bij het gebruik van andere dan gedestilleerd water vloeistoffen.

Momenteel worden de meeste microscopes werken op een horizontaal vlak met behulp van wit licht of kleurfilters, die nog steeds zeer breed in het golflengtegebied. Microscopen die echt gebruik maken van enkele golflengtes en flexibiliteit hebben in het bekijken van scenario, dwz horizontale plaatsing, zijn meestal beperkt tot een voordeel of het ander. Ook deze soorten microscopen zijn meestal erg duur en nog steeds beperkt tot beeldvlakken tegenstelling tot onze methode. De instelling kan gemakkelijk worden gebouwd met een extreem laag budget. Deze methode is klaar om te worden gebruikt door scholen, milieu-bedrijven en andere entiteiten die werken met weinig geld. In de toekomst kan deze methode worden gebruikt in een zeer geavanceerde setup realtime effecten op motoriek en mechanosensation microscopische soorten. Deze methode maakt enkele golflengte studie aan een breed scala aan invalshoeken en bekijken diepten gemakkelijk beschikbaar zijn.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij zijn dankbaar voor de steun van het Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), de Lucy Maynard Research Fund Zalm, NASA award No NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) award No 0630388 en de NSF award nummer 1058385.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander	Thorlabs	BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm	Thorlabs	LA1257

Referências

Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).
Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
Keller, H. E., Pawley, J. B. . Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. , (2011).
Demtröder, W. . Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , (2003).
Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).
Mood, A., Graybill, F., Boes, D. . Introduction to the Theory of Statistics. , (1974).
Taylor, J. R. . Classical Mechanics. , (2005).
Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
Bevington, P. R. . Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , (1969).
Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).
Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -. J., Zoval, J. V., O’Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genética. 177, 835-845 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).