JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Published: May 13, 2014
doi:
10.3791/51420
, , , , ,
1Centre for Gene Regulation and Expression, College of Life Sciences,University of Dundee, UK

Summary

Мы описываем технику для анализа глобального синтеза РНК в гипоксии с использованием изображений. Click-химию маркировка РНК ранее не были выполнены в условиях гипоксии и позволяет визуализировать глобальных изменений РНК на уровне одной клетки. Этот подход дополняет существующие усредненные методы РНК, что позволяет прямой визуализации клетки к клетке изменений в глобальном синтеза РНК.

Abstract

Гипоксии или снижение доступности кислорода участвует во многих физиологических и патологических процессов. На молекулярном уровне, клетки инициируют конкретную программу транскрипции для монтирования соответствующего и скоординированного клеточный ответ. Ячейка имеет несколько датчиков кислорода ферменты, которые требуют молекулярный кислород как кофактор для их деятельности. Они варьируются от пролил-гидроксилазы в гистонов деметилаз. Большинство исследований, анализирующих клеточные ответы к гипоксии основаны на клеточных популяций и средние исследований, и, таким одном анализе клеток гипоксических клеток редко выполняется. Здесь мы опишем метод анализа глобального синтеза РНК на уровне одной клетки в гипоксии с помощью Click-IT наборы изображений РНК в рабочей станции кислорода контролируется, с последующим анализом микроскопии и количественного. Использование раковые клетки подвергаются к гипоксии для различных отрезков времени, РНК помечены и измеряется в каждой клетке. Этот анализ позволяетвизуализация временных и от клетки к клетке изменений в глобальном синтеза РНК следующих гипоксического стресса.

Introduction

Гипоксия (низкий напряженность кислорода) происходит, когда нормальный подачи кислорода к ткани нарушается. Экологическая кислорода является одновременно питательный и сигнальная молекула, предоставляя важные сигналы для многих типов клеток. Изменения в окружающей кислорода воспринимаются группой диоксигеназ, которые контролируют деятельность важнейшего семьи фактора транскрипции известного как факторы индуцируемого гипоксией (ОПО). В ОПО состоят из двух субъединиц, α и β. Есть три известных (3 1, 2, и) изоформы HIF-α и несколько вариантов сплайсинга HIF-1β. HIF-1β конститутивно экспрессируется и не регулируется уровень кислорода окружающей среды 1. Члены семьи HIF-α динамически регулируется класса пролил-гидроксилазы (докторов наук) и фактором, препятствующим HIF (FIH); оба из которых требуют кислорода в качестве кофактора катализировать гидроксилирование HIF-α 2,3. В нормоксия члены семьи HIF-α гидроксилируются и отмеченных для proteosomаль деградация по E3-лигазы, Гиппеля Линдау (ВХЛ). В гипоксии кандидатов наук и ИФД неактивны или имеют пониженную активность. В HIF-α изоформы стабилизируется, образуют гетеродимер с HIF-1β, и влияет на транскрипцию генов, которые обеспечивают клеточный ответ на гипоксической среде (рис. 1А) 4.

Современные методы анализа РНК сосредоточиться на количественной оценке усредненных значений через данный клеточной популяции. Клетки реагируют на гипоксического стимула, инициируя транскрипцию множества генов, которые позволяют им приспособиться к их враждебной среде 5. Однако, гипоксия часто существует как градиента, и клетки в гипоксического среды не подлежат единой гипоксического стимула. Мы описываем реализацию комплектов визуализации РНК Click-IT в рабочей станции кислорода контролируется изучить глобальную синтез РНК на уровне одной клетки в гипоксии.

В комплект изображений РНК использует Alkyne модифицированный нуклеозид, 5-этинил уридин (ЕС) и Хемоселективное перевязки, чтобы включить обнаружение глобального синтеза РНК во времени и пространстве в клетках и тканях 6. Вкратце, клетки обрабатывают гипоксии и культивировали в присутствии ЕС. Затем они фиксированной и проницаемыми и включение ЕС в зарождающейся РНК обнаруживается Хемоселективное перевязкой ЕС с азидным содержащий краситель. Типичный рабочий процесс для этой реакции показана на фиг.1В. Мы использовали набор изображений РНК изучить синтез РНК на уровне одной клетки, что в результате обработки гипоксии.

Небольшой размер алкина тег обеспечивает эффективное включение модифицированного нуклеозида в РНК в частности. Хемоселективное перевязки или 'щелчок' Реакция сильно эффективный, быстрый и конкретных 7-10. Все компоненты реакции биоинертной, и реакционную не требует никаких экстремальных температур или растворители. Реакция нажмите отрицаеттребование для обычного радиоактивной метки и позволяет прямой визуализации результатов, так как на выходе, свет есть. Кроме того, молекула обнаружения может легко проникать сложные образцы, позволяющие мультиплексной анализа в том числе антител для детекции РНК-интерактивный белков. Этот анализ РНК изображений совместим с органических красителей в том числе Alexa Fluor и флуоресцеина (FITC).

Мы измерили изменение синтеза РНК после лечения наших клеток, используя реализацию открытом микроскопии среды для удаленных объектов (Omero). Omero это программа с открытым исходным кодом, доступно на http://openmicroscopy.org/ . Это программное обеспечение микроскоп для визуализации и анализа изображений позволяет получить доступ к и использование широкого спектра биологических данных, включая управление многомерных гетерогенных данных. Клиентское приложение позволяет дистанционно визуализацию и анализ сложных данных биологических изображения 11;мы использовали его для количественной визуальные изменения в глобальной и единой синтеза клеточной РНК. Эти данные и шаги, необходимые для анализа наш эксперимент изображений РНК с помощью этого микроскопа визуализацию изображения и программного обеспечения для анализа приведены ниже.

Мы смотрели на изменения в глобальной синтеза РНК следующих лечении человека остеосаркома (U2OS) клеток с гипоксии на срок до 24 часов. В любых условиях, мы обнаружили клетки к клетке изменение уровня производства РНК. Короткое время воздействия гипоксии не привело к существенным изменениям в уровне зарождающейся РНК в клетках. Однако воздействие 24 ч гипоксии привело к значительному увеличению количества РНК, полученного в клетках. Большинство клеточных ответов к гипоксии измерены следующие длительной экспозиции, например, от 4 до 24 часов. Тем не менее, некоторые механизмы ставятся на место гораздо раньше, например; NF-kB активация происходит в течение 5-15 мин гипоксии воздействия 12. Исследуя короткий гипоСя время экспозиции Поэтому вполне обоснованным и может отвлекать от более сложных ответов, таких как клеточного цикла и апоптоза.

Protocol

1. Культура клеток и лечение Соберите реагенты и оборудование, перечисленные в таблице 1 к человеческой культуры остеосаркома (U2OS) клеток. Подготовить все реагенты и проводить все методы культуры ткани в ламинарным укрытием воздушного потока для обеспечения стерильности Подготовка культуральной среды следующим образом: Добавьте 50 мл FCS, 5 мл L-глутамина и 5 мл пенициллина / стрептомицина на DMEM, чтобы достичь конечной концентрации 10% (FCS), 2 мМ (L-глутамина), 50 ед / мл ( пенициллин) и 50 ед / мл (стрептомицин). Теплый культуральной среды при 37 ° С на водяной бане. Подготовьте клеток для лечения: Стерилизовать несколько покровные в 70% этаноле, дайте высохнуть на воздухе и поместить один на нижней части шести 3,5 см пластинах. Погрузитесь покровные в 2 мл нагревают полный DMEM (37 ° С), нажимая с Покровное щипцов для того, чтобы они по-прежнему придерживался дно лунок. Отключите U2OS клетки от их ткани культаЮр пластина путем однократной промывки 3 мл PBS, применяя 4 мл нагревали 0,05% трипсин-ЭДТА (1%) и инкубации при 37 ° С в течение 7 мин. Ресуспендируют клеток в 6 мл нагревают полный DMEM для инактивации трипсина-EDTA и считать с помощью гемоцитометра. Виброплиты 2 х 10 5 клеток в каждом из см пластинах 3,5 подготовленной в точке 1.3.1. Осторожно покачайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Разрешить клетки придерживаться в течение ночи перед обработкой. Treat клетки, помещая четыре 3,5 см пластины в рабочую станцию ​​гипоксии и оставить остальные два 3,5 см пластин в инкубаторе при 37 ° С в нормальных условиях кислорода. Будьте готовы начать РНК маркировки анализа под обработанных условиях (в гипоксии камеры для гипоксии клеток, обработанных) 1 час до окончания лечения гипоксии. Защиту клеток к гипоксии в течение 1 ч 15 мин, 1 ч 30 мин, 2 ч и 24 ч. Эти временные точки являются гибкими и пользователем определена. Используйте нормоXIC 3,5 см пластина в качестве положительного контроля и нормоксических 3,5 см пластины, обработанной актиномицин D (10 мкг / мл конечная концентрация) в течение 4 ч в качестве отрицательного контроля. Актиномицин D является ингибитором глобального синтеза РНК. Особые указания: Hoechst 33342 является известный мутаген. ДМСО известно, чтобы облегчить проникновение органических молекул в ткани. NaOH вызывает коррозию. HCl вызывает коррозию. Параформальдегид высоко токсичен для всех животных и может привести к смерти человека. Triton X-100 может вызвать раздражение кожи после непосредственного контакта. Актиномицин D токсичен при контакте с кожей или проглатывании. Принять надлежащие меры предосторожности при обращении все опасные химические вещества. 2. Нажмите-IT анализа Собирают следующие реагенты, которые необходимы в дополнение к набор для анализа Click-IT: забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), рН 7,2 – 7,6, 3,7% параформальдегида (PFA) в PBS, 1% Тритон Х-100 В PBS, деионизированной воды (дН 2 O), диметилсульфоксид (ДМСО), 10 М гидроксид натрия (NaOH) и 37% раствор хлористоводородной кислоты (HCl); По желанию – рН индикатор полосы. Подготовьте свежий PFA маточного раствора до проведения реакции Нажмите-это следующим образом: Поместите 1,85 г PFA, 3,5 мл дН 2 O и 10 мкл из 10 М NaOH в 50 мл сокола трубки. Отварить 300 – 400 мл H 2 O в большом стакане в микроволновой печи, чтобы сделать на водяной бане и выдержать это в вытяжном шкафу. Поместите Falcon 50 мл в водяной бане и осторожно перемешивать в течение 10 мин, периодически выпускать крышку до тех пор, PFA не растворится. Шприц решение PFA через 0,2 мкм фильтр в другую 50 мл сокола трубы, в результате чего 37%-ного раствора. Развести этот 10x добавлением PBS и доведения рН до 6,8 добавлением приблизительно 12 мкл концентрированной HCl. Опция: Проверьте правильность рН с индикатором полос в вытяжной шкаф. Используйте немедленно или хранить оvernight при 4 ° C. Подготовьте исходные растворы набора изображений РНК следующим образом: Добавить 373 мкл дН 2 O, чтобы компонента А в результате исходного раствора 100 мМ ЕС. Хранить при -20 ° С в течение до одного месяца. Добавить 85 мкл ДМСО для компонента В (Alexa Fluor 594) и перемешать с помощью пипетки или встряхиванием. Храните и при -20 ° С в течение до одного года. Добавить 2 мл дН 2 O в компонент Е, чтобы создать решение 10X формирующей изображение РНК реакции комплект буферной добавки. Хранить при -20 ° С в течение до одного года, отбросить, когда решение развивает коричневый цвет. Маркировка элементов с ЕС: Подготовьте 2X рабочего раствора ЕС от мМ исходного 100, полученного на стадии 2.3 в предварительно нагретой полной среде (37 ° C) Выполните оставшуюся часть этого шага и шаг 2,5 в гипоксии камеры для клеток, обработанных гипоксии. . Разбавить до 1X добавлением равного объема этого рабочего раствора 2Х к медиа-ContAining клетки. Инкубировать в течение 1 часа при условиях культивирования клеток лечения. Сотовый Фиксация: Вымойте каждую лунку сразу с PBS и добавить 1 мл 3,7% PFA складе, подготовленные в шаге 2.2 выше в условиях лечения. Инкубировать 15 мин при условиях обработки. Образцы, обработанные гипоксии может быть удалена из камеры гипоксии в этой точке. Снимите фиксатор и мыть каждую лунку сразу с PBS (Позаботьтесь распоряжаться PFA тратить ответственно). Выполните следующие шаги при комнатной температуре. Пермеабилизации: Снимите промывочного раствора и добавить 1 мл 1% Triton X-100 в PBS в каждую лунку. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Снимите буфер пермеабилизации и мыть каждую лунку сразу с PBS. Меченой РНК обнаружения: Подготовьте свежий 1X рабочего раствора изображений РНК реакция комплект буферной добавки путем разбавления решение 10X (полученного на стадии 2.3) 1:10 в дН 2 O. Подготовьте набор изображений РНКРеакционную коктейль соответствии с таблицей 2 для использования сразу после приготовления. Снимите промывочного раствора и добавить 500 мкл изображений РНК реакции комплект коктейль для каждого образца. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, защищать от света. Снимите изображений РНК реакции комплект коктейль и мыть один раз с 1 мл изображений РНК реакции комплект полоскания буфера (компонент F), затем снимите изображений РНК реакции комплект полоскания буфер. Дополнительный мультиплекс реакция: Выполните дополнительную маркировку антитела образцов на данный момент в соответствии с рекомендациями производителя. ДНК Окрашивание: Вымойте образцы с PBS затем снимите промывочного раствора. Развести Hoechst 33342 (Компонент G) 1:1000 в PBS. Добавьте 1 мл разведенного Hoechst 33342 в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре, защищать от света. Снимите 33342 решение Hoechst и промыть клетки дважды PBS. Снимите мытья SOLUTIOн и перейти к световой микроскопии. 3. Световая микроскопия Mount Покровные: Поместите 10 мкл среды монтаж по центру стандартной стекло микроскопа. Поместите покровное с мобильного стороной вниз в центре предметное стекло для покрытия аликвоты монтажной среды. Позаботьтесь, чтобы избежать возникновения пузырьков в монтажную среду, так как это скроет последующее получение изображений. Придерживайтесь покровное к предметное стекло с применением четкой лак для ногтей, чтобы его периметру. Дайте высохнуть в течение 5 мин при комнатной температуре. Беречь от света. Образцы можно хранить при -20 ° С с последующим монтажа. Получение изображений: Получение изображений с использованием широкого поля микроскопа, способного регистрации флуоресценции. Приблизительное излучение максимумы флуоресценции / возбуждения для красителя Alexa Fluor и Hoechst 33342, связанного с ДНК приведены в таблице 3. Perforм изображений с использованием нефти погружения объектив 40X/1.30 НС и захват изображений с охлаждаемой ПЗС-камеры. 4. Анализ данных Деконволюции изображения, используя программное обеспечение для обработки изображений (см. таблицу материалы) перед импортом клиенту Omero. Нормализовать оказание настройки для всех изображений в том же эксперименте в программном обеспечении микроскоп визуализации и анализа изображений, применяя настройки рендеринга от управления нормоксических клеток для всех других условий. Используйте интересующей области (ROI) инструмента в программном обеспечении микроскоп визуализации и анализа изображения (см. таблицу материалов), чтобы выбрать ядра из каждого изображения. Получить средние интенсивности для каждого ROI и рассчитать среднее и стандартное отклонение для каждого условия, выбрав опцию анализа интенсивности, в том числе ряд между 30-50 клеток. Построить диаграммы рассеяния с помощью программного обеспечения графиков данных (см. таблицу материалов), откладывая все индивидуальные значения средней интенсивности, полученной на стадии 4.2 то отражают изменчивость между клетками при каждом условии. В качестве альтернативы построить гистограммы представлять среднегодовая интенсивность плюс стандартное отклонение зарождающейся РНК.

Representative Results

Схема реакции набора изображений РНК показано на фиг.1В. Мы использовали эту реакцию для количественного определения общего синтез РНК в клетках U2OS после лечения гипоксии на как на индивидуальном (Single Cell) и глобальном уровне (популяция клеток). Клетки обрабатывали с гипоксией и культивировали в присутствии ЕС. Затем они фиксировали и проницаемыми и включение ЕС был обнаружен Хемоселективное перевязкой ЕС с азидным содержащий краситель. Этот щелчок, результаты реакции в флуоресценции, которые могут быть обнаружены и количественно с помощью флуоресцентной световой микроскопии. Фиг.2А показан типичный результат этого эксперимента. Флуоресцентно меченые клетки псевдоцветной красный и образ был открыт в открытом микроскопии среды для удаленных объектов (Omero). Это программное обеспечение микроскоп для визуализации и анализа изображений имеет встроенный инструмент ROI, который может использоваться для выбора индивидуального субклеточных струквания и количественно проанализировать интенсивность изображения в выбранном регионе. Типичным примером выходных данных после использования этого инструмента в клиентской программы можно видеть на фиг.2В; Отдельные клеточные интенсивности показано рядом представительного изображения из эксперимента, который служит визуальным контролем, чтобы обеспечить достоверность данных. Отдельные интенсивности флуоресценции клеток могут быть нанесены в виде точечной диаграммы, чтобы показать распределение отдельных сотовых интенсивности в пределах обработанной клеточной популяции. Примером такого типа графика видно на фиг.2С. Построение данных интенсивности, таким образом, является полезной, поскольку она позволяет быстрое сравнение результатов лечения и четко демонстрирует значительное гетерогенность в пределах лечение клеточной популяции, которая в противном случае закрываемое с использованием стандартного представления данных. Неоднородность ответ Интересно в этом эксперименте, потому что хотя единая гипоксического стимула былpplied к клеткам, очевидно, что каждая клетка из того же населения монослоя по-разному реагирует на этот раздражитель. Рисунок 2D изображает общий результат нашего эксперимента. Интенсивности флуоресценции от всех клеток внутри популяции лечения были усреднены и затем нанесены в этом гистограммы. Т-тест учащегося была использована для расчета статистическую вероятность каждой группе лечения значительно отличающейся от контроля. Интересно, что эти данные показывают, что существует статистически существенное увеличение глобального синтеза РНК в течение долгого времени, когда U2OS клетки обрабатывают гипоксии (иногда более 1 ч 30 мин * р <0,01;. ** Р <0,05 и р *** <0,001 и п> 30). Эти данные показывают, что после длительного периода лечения гипоксии, клетка фокусируется свои усилия на производстве РНК даже в этой враждебной гипоксического среды. Актиномицин D лечение полностью ablates интенсивности флуоресценции как и ожидалось. Рисунок 1. Система А. HIF реагирует на изменения в клеточном кислорода. В этом упрощенном схематическом гипоксии стабилизирует HIF гетеродимер, предотвращая HIF-α гидроксилирование (-ОН) по пролилгидроксилазы ферментов (PhDs) и его последующего polyubquitination по фон Хиппель-Линдау белка (VHL). Результаты стабилизации HIF в активации множества генов, которые помогают клеток реагировать на клеточном гипоксии Б. синтез РНК могут быть обнаружены с помощью Click-IT анализа.; клетки помечены ЕС после лечения Нажмите реакция обнаруживает синтез РНК, которые могут быть количественно по интенсивности флуоресценции и световой микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное испионный этой фигуры. Рисунок 2. А. Скриншот из Omero показать типичный микроскопический вывод следующий РНК маркировки. Это программное обеспечение микроскоп для визуализации и анализа изображений для быстрого извлечения данных интенсивности на индивидуальном уровне клеток, используя его встроенный макрос ROI. Скриншот из вывода этой команды показан на синтезе В. Глобальная РНК может быть выведено из интенсивности отдельной ячейки, диапазон которой можно увидеть в точечной диаграммы С. формальное представление этих агрегированных данных видно D. * р <0,01; ** Р <0,05 и *** р <0,001 и п> 30. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение. <tablэ граница = "0" CellPadding = "0" CellSpacing = "0"> Культура клеток Реагенты Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), рН 7,2 – 7,6 Игла в модификации Орлы (DMEM) Фетальной телячьей сыворотки (FCS) стерилизовали фильтрованием Пенициллин / стрептомицин L-глютамин 0,05% Трипсин-ЭДТА (1%) 70% этанол Актиномицин D (1 мкг / мкл акций) Культура клеток оборудование Стерильные пипетки Пастера Диапазон культуре клеток, обработанных пластиковой посуды, пригодной для содержания и лечения клеток в культуре Водяной бане при 37 ° С Ламинарный капот воздушный поток Инкубатор установить при 37 ° С, 5% СО 2 Гипоксия Рабочая станция установлена ​​на уровне 37 ° С, 5% СО 2, 1% О 2 Стеклянные покровные прецизионные щипцы Гемоцитометра Таблица 1. Реагенты и оборудование, необходимые для культивирования U2OS клеток. Компоненты реакции Количество покровные 1 2 4 5 6 10 Click-IT реакция РНК буфера (Компонент С) 428 мкл 856 мкл 1,7 мл 2,1 мл 2,58 мл 4,3 мл CuSO 4 (Компонент D) 20 мкл 40 мкл 80 мкл 100 мкл 120 мкл 200 мкл Alexa Fluor Азидное (полученного на стадии 2.3) 1,8 мкл 3.7 мкл 7.4 мкл 9.3 мкл 11.28 мкл 18.8 мкл Click-IT реакционный буфер добавка (полученного на стадии 2.3) 50 мкл 100 мкл 200 мкл 250 мкл 300 мкл 500 мкл Приблизительная Общий объем 500 мкл 1 мл 2 мл 2,5 мл 1,5 мл 5 мл . Таблица 2 визуализации РНК реакции комплект коктейли: Справочная таблица подробно соотношение компонентов смеси мастер для формирования изображения РНК реакции Набор по количеству покровные быть окрашены. Флуорофора Возбуждение (нм) Эмиссия (нм) Alexa Fluor 488 495 519 Hoechst 33342, связан с ДНК 350 461 . Таблица 3 выбросов максимумы флуоресценции / возбуждения: Приблизительная выбросов максимальная флуоресценция / возбуждения Alexa Fluor красителя и Hoechst 33342, связанного с ДНК.

Discussion

Мы описали наше использование комплектом изображений РНК для изучения последствий гипоксии на синтез РНК в остеосаркома (U2OS) клеток. Этот метод является относительно простым и предоставляет данные о глобальном транскрипции на одном уровне клетки. Мы изменили обычный протокол для этого набора, чтобы включить маркировку в гипоксии камеры. Насколько нам известно, это первый отчет об использовании этого метода для определения изменений в синтезе РНК в гипоксии. В комплект изображений РНК мы использовали подходит для экспериментов в гипоксии, так как это не требует никаких радиоактивных изотопов и технически совместимы с ограничениями работают в контролируемой рабочей станции атмосферы. Общие проблемы с этим техника концерна эффективной фиксации и маркировки образца. Крайне важно, что PFA используется для фиксации образец свежая, и мыть шаги, которые следуют за реакцию "нажмите кнопку" выполняются, как описано для обеспечения низкого фонового окрашивания образца. Если бсходная флуоресценции становится проблемой, рекомендуется мыть еще раз с РНК изображений 1 мл реакция комплект полоскания буфера после шага 2.7.4.

В комплект изображений РНК упомянуты здесь представляет собой значительный шаг вперед в области технологий визуализации РНК с точки зрения простоты использования и специфичности и скорости реакции. Этот метод в основном ограничивается время, необходимое для обозначения образца. В комплект изображений РНК требует маркировки период 1 час, который предотвращает рассмотрение быстрых изменений в глобальной РНК, которые, как правило, происходят в этот период времени. Именно по этой причине наш первый раз точка ограничивается 1 ч и 15 мин. Методика связан с несколькими другими ограничениями, которые в значительной степени имеют отношение к реагента совместимость с другими флуоресцентными маркерами, например, этот комплект изображений РНК не совместим с окрашиванием фаллоидином.

Все существующие подходы изучения синтеза РНК в клетках основаны на введении модифицированных нуклеозидов ввозникающий РНК и обнаружение включены этикеток с помощью других средств. Новаторский подход был основан на использовании радиоактивно меченных предшественников РНК с последующим обнаружением с авторадиографией. Этот метод привел к открытию стадиях клеточного цикла и других важных результатов; Однако, он имеет много недостатков, таких как громоздкости радиоактивности работы, длительных выдержек и изображения с низким разрешением ауторадиографии 6. Следующим шагом вперед в области эксплуатации средств иммунохимии, чтобы устранить необходимость радиоактивности. РНК метили путем включения Брю последующим обнаружением иммунохимии. Тем не менее, эффективный связывание антитела требуется денатурации нуклеиновой кислоты, чтобы улучшить доступ к ДНК или РНК, которая вызвала потерю морфологии клеток и поврежденных эпитопы многих белков, предотвращая их дальнейшее обнаружение с флуоресцентной меченых антител 13. Внедрение технологии «клик химии" упростил шаг обнаружения и тон процедура по сравнению с авторадиографией и иммунохимии. Технология основана на азид-алкина Huisgen реакции циклоприсоединения где терминал алкина 5-ethyniluridine связывается с азидом, конъюгированного с флуорофора в присутствии Cu (I). Реакционную специфичен, быстрый, не требует никаких дополнительных действий, и легко совместим с иммунохимического выявления других компонентов клеток.

Используя эту технологию визуализации РНК мы показали, что клетки, в той же популяции монослоя, имеют различные уровни синтеза РНК в ответ на гипоксию. Мы ограничили наш эксперимент, чтобы изучить влияние только производства РНК; однако, это вполне возможно с помощью этого комплекта изображения РНК выполнить модификацию, дополнительные мультиплексных реакций, которые позволяют более сложной анализа производства РНК. Например, вторичный окрашивание с использованием антитела, специфичного для маркеров активной транскрипции, таких как уровни фосфорилированного РНК-полимеразы II или даже компонентов трансляцииТион техника, чтобы дать представление о размере этого вновь произведенной РНК, которая превращается в белок возможны. Дополнительные белки, такие как актин, белок, который не должен существенно изменить с гипоксией, могут быть проверены в качестве дополнительного контроля. Кроме того, различные типы клеток могут быть проверены, так как это очень вероятно, что разные клетки будут иметь разные цены синтеза РНК и даже разные ответы на гипоксию.

Использование этого комплекта визуализации РНК довольно проста при условии, что шаги выполняются, как описано. Критические шаги в протоколе включать покрытие клеток, фиксацию клеток и окрашивание и захвата изображений. Важно пластины клеток в описанной плотности, чтобы предотвратить над или под слияния в опытам, будет существенно влиять на результат. Важно также, чтобы использовать свежий фиксатор, обеспечивая лучший «снимок» ячейки берется и заботиться, когда промывки клеток после окрашивания, чтобы уменьшить баккараkground до уровня, который является приемлемым для эффективного анализа. Наконец, метод получения изображения является жизненно важным для достижения изображения, которые имеют достаточно хорошее качество для последующего анализа. Мы рекомендуем использовать лучший световой микроскоп доступной для изучения образцы оптически такие как микроскоп используется в данном протоколе, который можно купить в большинстве наукоемких центров по всему миру.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JB является клиническим сотрудник CRUK, как студент Wellcome Trust доктор философии, SR лаборатория финансируется за счет CRUK старший научный стипендий (C99667/A12918). Эта работа была поддержана двумя Wellcome Trust стратегических решений (097945/B/11/Z и 095931/Z/11/Z).

Materials

U-2 OS Primary Cells European Collection of Cell Cultures 92022711 http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true
PBS Gibco 14190094 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094
DMEM Gibco 41966029 https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029
FCS Gibco 10270106 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106
Penicillin/Streptomycin Lonza DE17-603E http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx
L-Glutamine Lonza BE17-605E http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx
0.05% Trypsin-EDTA (1%) Gibco 25300062 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062
Hypoxia Chamber Ruskinn InVivo2 300 http://www.ruskinn.com/products/invivo2300
Click-iT assay Kit Invitrogen C-10329/C10330 http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D
pFA Sigma 76240 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&region=GB
Triton X-100 Sigma X-100 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&region=GB
10M NaOH Sigma 72068 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&region=GB
37% HCl VWR 20252.335 https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or
VectaShield Mounting Medium Vector Laboratories H-1400 http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483
Actinomycin D Sigma A9415 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&region=GB
Deltavision Core Microscope Applied Precision N/A http://www.appliedprecision.com/
softWoRx [Refered to in text as image processing software] Applied Precision N/A http://www.api.com/softworx.asp
CoolSnap HQ2 CCD Camera Photometrics N/A http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] OME N/A http://openmicroscopy.org/
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] Systat Software Inc. N/A http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
  2. Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
  3. Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
  4. Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
  5. Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
  6. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
  7. Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
  8. Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
  9. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  10. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  11. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
  12. Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
  13. Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on “click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).

Tags

Single Cell AnalysisRNA SynthesisHypoxiaOxygen SensingTranscriptional ResponseCancer CellsMicroscopy AnalysisClick-iT RNA Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Biddlestone, J., Druker, J., Shmakova, A., Ferguson, G., Swedlow, J. R., Rocha, S. Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia. J. Vis. Exp. (87), e51420, doi:10.3791/51420 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image