Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Alle donateurs geworven voor deze studie gaf schriftelijke informed consent en de studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Review Board. 1. HUVEC Initiële Cultuur en Subculture Cultuur humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) in vitro in volledige groeimedium dat bestaat uit endotheelcellen basaal medium (zie lijst van materialen), aangevuld met endotheelcelgroei factoren. Opmerking: De groeifactoren die in deze studie zijn: 5 ng / ml humane recombinante epidermale groeifactor (hEGF), 1,0 mg / ml hydrocortison, 50 mg / ml gentamicine en 50 ng / ml amfotericine-B (GA-1000), 2 % foetaal runderserum (FBS), 0,5 ng / ml Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), 10 ng / ml humaan fibroblast groeifactor-basis met heparine (hFGF-B), 20 ng / ml recombinant humaan insuline-achtige groeifactor ( R3-IGF-1), 1 ug / ml ascorbinezuur en 22,5 ug / ml heparine. Het compleet mediumaanvankelijk bereid bij 37 ° C en kan vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand na bereiding. Aan een kolf van cellen te bereiden, wordt volledig groeimedium toegevoegd aan een 75 cm2 weefselkweek kolf (1 ml / 5 cm2) en de kolf wordt equilibreren tot 37 ° C / 5% CO2 in een bevochtigde incubator ten minste 30 minuten. Menselijke HUVEC gaat rechtstreeks geënt in deze geëquilibreerd kolf met een dichtheid van 2.500-5.000 cellen / cm 2. Terwijl de media zich evenwichtsherstellende, snel ontdooien de voorraad HUVEC cryovial in een 37 ° C waterbad. Dispergeer de cellen in de oorspronkelijke opslag vaatje door vortexen en voeg deze dan direct aan de cultuur kolf die het pre-geëquilibreerd HUVEC compleet groeimedium tot een dichtheid van 2.500-5.000 cellen / cm 2 bereiken. Schud de kolf om gelijkmatig te verdelen de cellen en dan terug de kolf naar de incubator. Deze cellen vormen nu de 1e passage. <li> Medium moet om de twee dagen worden gewijzigd totdat de cellen 70-80% confluent. De HUVECs kan nu worden geoogst uit de kolf met trypsine / EDTA. De cultuur media wordt opgezogen uit de kweekflessen gevolgd door een PBS spoelen om eventuele resten eiwit en calcium uit de cellen te verwijderen. A 0.25% trypsine-EDTA-oplossing toegevoegd en binnen 2-6 minuten cel loslating moet blijken zoals bepaald met lichtmicroscopie. Wanneer 90% van de cellen boven worden afgerond de plaat, stop de trypsine door toevoeging van een gelijk volume van 2x trypsine remmer. Om de oogst van de cellen te vergemakkelijken, voeg nog eens evenveel compleet groeimedium. Breng de losgemaakte cellen naar een steriele 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer de losgemaakte cellen bij 225 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 2-3 ml compleet kweekmedium. Bepaal de cel concentratie en levensvatbaarheid van het gebruik van een hemacytometer en Trypan Blue. Om th gebruikene geoogste cellen te bestuderen, re-seed extra 75 cm2 kolven met cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm 2 en verder naar stap 2.2. Als alternatief kunnen de cellen op dit punt worden ingevroren voor toekomstige studies. Voor cellen bevriezen, pellet de cellen door centrifugatie bij 225 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in FBS dat 10% DMSO bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. De celsuspensie wordt vervolgens overgebracht naar cryoflesjes en bewaard bij -80 ° C na bevriezen van de cellen in een cel bevriezing container. 2. HUVEC Layer Voorbereiding Gebruik van bevroren 2 e passage HUVECs: revival en cultuur. Bij gebruik van actief groeiende cellen, ga dan naar stap 2.2. Ontdooi de cryovial met 2 e passage HUVECs vanaf stap 1.8 al snel in een 37 ° C waterbad. Transfer cellen van de cryovial om een ​​15 ml steriele centrifugebuis en voeg 10 ml groei medium. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant om de resterende DMSO te verwijderen. Resuspendeer de celpellet met complete groeimedium en breng de cellen in een 75 cm2 kolf. Voeg groeimedium tot een volume ongeveer 20-25 ml en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2. Visueel onderzoek van de celcultuur voor samenvloeiing elke dag met de media verandert om de twee dagen. Binnen 2-4 dagen zullen de cellen 80-90% confluentie waarna zij klaar voor gebruik in de stroom kamer assay wordt bereikt. De kweekschaal die wordt gebruikt in de stroom kamer bereiden (zie sectie 5), voeg 1 ml van 10 ug / ml fibronectine en 0,05% (w / v) gelatine een 35 mm weefselkweekplaat en pipet enkele malen om dat het gehele plaatoppervlak wordt gecoat. Verwijder het buitensporige fibronectine en gelatine-oplossing en lucht drogen de plaat gedurende tenminste 30 minuten om de vorming van eiwit matrix optimaliseren. De fibronectin en gelatine oplossing kan worden hergebruikt tot 10x. Oogst de HUVEC-cellen van stap 2.2 met trypsine-EDTA zoals beschreven in stappen 1.5-1.7. Zaad 500.000 cellen in elk gecoat weefselkweek schotel. Voeg 2 ml kweekmedium per schotel en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2. Laat cellen om te groeien tot confluentie zoals in stap 2.2. De cellen moeten dagelijks visueel worden geïnspecteerd met medium verandert om de twee dagen. Vóór de stroom kamer assay, vul de HUVEC met 20 ng / ml humaan TNF-α gedurende 4-6 uur te upregulate stimuleren en expressie van adhesiemoleculen. 3. Gezuiverd Ligand Coating Teken een cirkel van 0,5 cm diameter met een marker of pen in het midden van een 35 mm weefselkweekplaat. Plaat 20 gl 20 ug / ml proteïne A in het aangegeven gebied. Gebruik de pipetpunt om het proteïne te spreiden een oplossing voor het gehele gebied binnen de cirkel van 0,5 cm diameter dekken. Het is belangrijk om niet aanraken of krassen op het oppervlak van de dish. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Was de proteïne-A gecoate plaat 3x met 1 ml PBS (pH 8,0). Plaat 50 pi 1% BSA in het aangegeven gebied te blokkeren niet-specifieke binding aan de plaat. Incubeer 2 uur bij 4 ° C. Was de geblokkeerde plaat 3x met 1 ml PBS zoals in stap 3.3. Bereid de Fc-adhesiereceptor ligand chimere eiwit oplossingen voor coating. In dit experiment werd een chimeer ICAM-1/Fc oplossing van 25 ug / ml en een P-Selectin/Fc chimeer bij 0,5 ug / ml in PBS (pH 8,0) werd gebruikt. Coat de gemarkeerde gebied met 50 pi substraat. Incubeer overnacht bij 4 ° C. De schotel moet binnen twee dagen en het beklede gebied mag niet uitdrogen. Voeg PBS indien nodig de 50 ul oplossing op de plaat te houden. 4. Neutrofiel Separation (alle stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur) Na het verkrijgen van informed consent, verzamelen deelnemer bloed door aderlatingen in eenn antistollingsmiddel bloedafname of vacutainer (EDTA of heparine). Na bloedafname, verdunnen het bloed 1:1 met PBS vóór de scheiding. Bereid een tweelaags Ficoll voor het scheiden van PBMC en neutrofielen in 50 ml centrifuge buizen. Voeg eerst 15 ml zware Ficoll (zie lijst van materialen, ρ = 1,118-1,120), en vervolgens zorgvuldig laag 10 ml licht Ficoll (zie lijst van materialen, ρ = 1,077-1,080) op de top van de zware Ficoll. Er moet een scherpe grens tussen de lichte en zware Ficoll Ficoll lagen. Tenslotte zorgvuldig laag 25 ml van het verdunde bloedmonster op de top van het licht Ficoll zonder de Ficoll laag. Centrifugeer het buisje bij 250 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroerd. Opmerking: De rem centrifuge rotor moet uit zijn deze spins mogelijke verstoring van de cel scheiding bij rotor afremmen aan het einde van het centrifugeren te minimaliseren. Na centrifugatie worden de volgende lagen (van boven naar beneden) aanwezig: de toplaag is het volgende op plasmawed de PBMC laag boven op de Ficoll-laag licht, neutrofielen laag met weinig rode bloedcellen (RBC) tussen de lichte en zware Ficoll gevolgd door de zware Ficoll laag en RBCs bij de bodem van de buis. Oogst en breng de neutrofielen laag in een nieuwe buis van 50 ml met een transfer pipet PBS tot een eindvolume van 50 ml en centrifugeer bij 225 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Na centrifugeren, kunnen er nog steeds RBCs gemengd met de neutrofielen. Zuig het supernatant tot aan de 10 ml markering. Resuspendeer de neutrofiel-RBC pellet door voorzichtig schudden van de buis (of een korte lage snelheid vortexen) en opnieuw wassen met 50 ml PBS. Na de tweede wasbeurt, zuig het supernatant. Om de verontreinigende rode bloedcellen te verwijderen, resuspendeer de gepelleteerde cellen in de resterende PBS door roeren (of kort vortexen), voeg 25 ml H2O en voorzichtig vortex gedurende 10 seconden te lyseren RBC. Voeg 25 ml 1,8% NaCl en meng onmiddellijkdoor centrifugatie bij 225 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De besmetting van RBC moet nu worden gelyseerd verlaten van een witte neutrofielen cel pellet. Was de neutrofielen cel pellet met PBS. Resuspendeer de geïsoleerde neutrofielen in RPMI-medium met 10% FBS en bepaal de celconcentratie onder lichtmicroscoop met een hemocytometer. Pas de celdichtheid 500.000 cellen / ml met compleet RPMI-10% FBS-medium. 5. Flow Kamer adhesietest Monteer de stroom kamer. Plaats de 35 mm schotel met de samenvloeiing HUVECs of gezuiverde adhesie receptor liganden op de microscoop tafel. Sluit de parallelle plaat stroom kamer met injectiepomp, vacuümsysteem en laat een lijn geopend voor de neutrofielen ingang. Steek de stroom kamer op de bovenkant van de plaat en zet de stroom kamer montage 13. (Zie figuur 1) Start de video-opname programma op de computer is aangesloten to de microscoop. Stel het veld en focus van de microscoop totdat een heldere veld met volgroeide HUVEC cellen of een veld in het ligand coatinggebied zichtbaar. Met behulp van de injectiepomp, spoel de stroom kamer met RPMI medium. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer of de neutrofielen lijningang. Desgewenst kan de neutrofielen worden gegrond met lage dosis (10 -8 M) fMLP gedurende 10 minuten. Dit zal zorgen voor een afstemming van het basale niveau van neutrofielen activering tussen verschillende donoren 14. De spuit pomp neutrophils injecteren in de stroming kamer bij bepaalde snelheden (een snelheid van 350 pl / min, waarbij een afschuifspanning van 1,5 dyne / cm 2 gelijk wordt gebruikt in deze studie). Noteer de video. Omdat neutrofieladhesie snel optreden, een video met een lengte van 4-5 minuten is meestal voldoende om hechting gebeurtenissen voor analyse kwantificeren. Een hechtende cel wordt gedefinieerd als een cel die minder dan een celdiameter beweegtbinnen 5 seconden op de HUVEC of ligand gecoate oppervlak 15,16. Tel het aantal hechtende cellen in het gebied in de opgenomen video met deze regel. Door het opnemen van vergelijkbare lengte van video's met neutrofielen verschillende donoren ', kan men de hechtende cellen / min berekenen van de hechting tussen de verschillende donoren te vergelijken.