Cellule gangliari retiniche (RGC) esprimono L, N-, P / Q e T-tipo VGCC come determinato attraverso il blocco farmacologico di queste componenti della cellula intera Ca canale corrente ^1,2. VGCC sono proteine ​​transmembrana multimerici che sono coinvolte nel rilascio del trasmettitore, la trascrizione del gene, regolazione cellulare e sinaptica plasticità ^3,4,5. VGCCs funzionali sono costituiti da almeno tre classi distinte di subunità: grandi, transmembrana α ₁ formano pori subunità che stabiliscono proprietà biofisiche e farmacologiche del canale, α ausiliario principalmente extracellulare ₂ subunità δ e subunità β intracellulari. Gli ultimi due complessi di forma eteromerici con diverse subunità α ₁ e alterano la cinetica gating e il traffico dei canali alla membrana plasmatica ^6.

Negli ultimi decenni, molte tecniche sono state impiegate per lo studio delle proteine ​​espresfissione, come la immunoistochimica, enzyme-linked test immunoenzimatico, analisi occidentale e citometria a flusso. Queste tecniche richiedono l'uso di anticorpi specifici per l'individuazione di una data proteina di interesse e forniscono strumenti potenti per la localizzazione e la distribuzione di proteine ​​specifiche nei diversi tessuti. Le tecniche utilizzate per rilevare e quantificare i livelli di espressione di mRNA di una particolare proteina come l'analisi Northern blot, RT-PCR, real-time RT-PCR, ibridazione in situ, cDNA microarray e analisi di protezione della ribonucleasi forniscono un approccio alternativo quando gli anticorpi non sono facilmente livelli di espressione disponibile o se di una particolare proteina sono bassi ^7. Tuttavia, una limitazione all'uso di tali tecniche molecolari è l'identificazione desiderata della sequenza genica.

Per localizzare proteine ​​nella retina, immunoistochimica può essere eseguita su retine wholemount. A causa della accessibilità dei RGCs, la wholemountpreparazione fornisce una piattaforma eccellente per studiare la localizzazione di specifiche proteine ​​al somata RGC e dei loro assoni.

Oltre alla loro localizzazione, alcune proprietà funzionali dei VGCCs in RGC sono evidenziabili attraverso l'uso di tecniche di imaging calcio. Descriviamo un protocollo di imaging del calcio di etichettare selettivamente RGCs con un indicatore di calcio colorante per misurare la dinamica del calcio intracellulare. Il contributo di diversi VGCCs al segnale calcio in differenti compartimenti cellulari può essere isolata con l'uso di specifici del sottotipo Ca bloccanti dei canali.

Forse uno degli aspetti più positivi della tecnica di imaging del calcio qui descritta è la capacità di registrare simultaneamente e indipendentemente da più RGCs e dei loro assoni. Anche se molte tecniche fisiologiche, come ad esempio intera registrazione patch clamp cellulare, forniscono ad alta risoluzione temporale registrazioni delle correnti di membrana, il somatico o fonte assonale di thesE le correnti registrate non possono essere discriminati e registrazioni possono essere effettuate solo da un singolo neurone alla volta. Array multielettrodico (MEA) sono in grado di registrare simultaneamente punte da molte cellule, ma possono né rilevare né discriminare l'attivazione di, ad esempio, diversi sottotipi di canali del calcio. MEAS preferenzialmente registrare da cellule che si trovano in prossimità di un dato elettrodo ⁸ e registrare da cellule che generano grandi picchi ^9. Metodi di imaging ottici forniscono una strategia alternativa per consentire le registrazioni simultanee e indipendenti di intere popolazioni di cellule che possono essere integrate con le informazioni ottenute da microelettrodo singola cellula e la registrazione patch clamp e la registrazione MEA. Sebbene le tecniche di imaging del calcio qui descritti sono stati impiegati per studiare la dinamica del calcio di RGCs, patch clamp e MEA può essere utilizzato anche in parallelo per chiarire ulteriormente le correnti ioniche e spiking proprietà dei RGCs.

<pclass = "jove_content"> Dato che le cellule amacrine sfollati costituiscono circa il 60% della popolazione neuronale nello strato di cellule gangliari della retina di topo ^10, il nostro obiettivo era quello di utilizzare una tecnica di carico che etichette selettivamente RGCs con un indicatore di calcio sintetico colorante in un preparazione wholemount. Sebbene coloranti sintetici indicatori di calcio offrono una piattaforma eccellente per lo studio della dinamica del calcio intracellulare, la sua diffusione è stata ostacolata dall'incapacità di caricare efficacemente specifiche popolazioni di neuroni all'interno di una data rete. Molte tecniche come la massa di carico ¹¹ ed elettroporazione ^8,12 sono stati eseguiti per caricare intere popolazioni di cellule, tuttavia, tali tecniche non discriminano tra i tipi cellulari specifici. Geneticamente codificati indicatori di calcio offrono la possibilità di etichettare selettivamente specifiche popolazioni di cellule, tuttavia, tali metodi richiedono la generazione di animali transgenici ^13. La nostra tecnica descrive un metod di etichettare selettivamente RGCs nella preparazione wholemount tramite ottico iniezione moncone del nervo di un indicatore di calcio colorante.

Nel loro insieme, le tecniche strutturali e fisiologiche descritte in questo articolo fornire una piattaforma per studiare la localizzazione e il contributo delle VGCCs al segnale calcio nel RGCs e dei loro assoni.