Wholemount चूहा रेटिना में immunohistochemical और कैल्शियम इमेजिंग तरीकों
Summary
Immunohistochemistry प्रोटोकॉल रेटिना में एक विशिष्ट प्रोटीन का स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. कैल्शियम इमेजिंग तकनीक रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैं.
Abstract
इस पत्र में हम उपकरण, अभिकर्मकों, और के लिए आवश्यक हैं कि व्यावहारिक कदम वर्णन: immunohistochemistry के लिए wholemount retinas की 1) सफल तैयारी और, रेटिना में कैल्शियम संकेतन मध्यस्थता वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (VGCC) के अध्ययन के लिए 2) कैल्शियम इमेजिंग नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं. कैल्शियम इमेजिंग विधि हम नाड़ीग्रन्थि सेल परत में विस्थापित amacrine कोशिकाओं की गैर विशिष्ट लोडिंग के विषय में गतिरोध उत्पन्न मुद्दों का वर्णन.
Introduction
वर्तमान 1,2 चैनल Ca पूरे सेल के इन घटकों के औषधीय नाकाबंदी के माध्यम से निर्धारित रूप में रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) एल, एन, पी / क्यू और टी प्रकार VGCC व्यक्त करते हैं. VGCC ट्रांसमीटर रिहाई, जीन प्रतिलेखन, सेल विनियमन और synaptic plasticity 3,4,5 में शामिल कर रहे हैं कि transmembrane multimeric प्रोटीन होते हैं. 1 ताकना चैनल के biophysical और औषधीय गुणों, मुख्य रूप से बाह्य सहायक α 2 δ सब यूनिटों और intracellular β सब यूनिटों की स्थापना कि सब यूनिटों के गठन α बड़े, transmembrane: कार्यात्मक VGCCs सब यूनिटों के कम से कम तीन अलग वर्गों से बना रहे हैं. अलग α 1 सब यूनिटों के साथ बाद के दो फार्म heteromeric परिसरों और प्लाज्मा झिल्ली से 6 चैनलों के gating कैनेटीक्स और तस्करी में परिवर्तन.
हाल के दशकों में, कई तकनीकों प्रोटीन expre अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया हैऐसे immunohistochemistry, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख, पश्चिमी विश्लेषण और प्रवाह cytometry के रूप में ssion,. इन तकनीकों में रुचि का एक दिया प्रोटीन का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता है और विभिन्न ऊतकों में स्थानीयकरण और विशिष्ट प्रोटीन के वितरण के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं. एंटीबॉडी आसानी से नहीं कर रहे हैं जब इस तरह के उत्तरी धब्बा विश्लेषण के रूप में एक विशेष प्रोटीन का mRNA अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने और यों इस्तेमाल की तकनीक, आरटी पीसीआर, वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी पीसीआर, सीटू संकरण में, सीडीएनए प्रोटीन और ribonuclease संरक्षण परख एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान एक विशेष प्रोटीन की उपलब्ध या तो अभिव्यक्ति के स्तर 7 कम कर रहे हैं. हालांकि, इस तरह के आणविक तकनीक का उपयोग करने के लिए एक सीमा जीन अनुक्रम की आवश्यक पहचान है.
रेटिना में प्रोटीन स्थानीय बनाना, immunohistochemistry wholemount retinas पर प्रदर्शन किया जा सकता है. RGCs की पहुंच के लिए, wholemount कारणतैयारी RGC somata और उनके axons के लिए विशिष्ट प्रोटीन का स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है.
उनके स्थानीयकरण के अलावा, RGCs में VGCCs के कुछ कार्यात्मक गुण कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के उपयोग के माध्यम से प्रदर्शन किया जा सकता है. हम चुनिंदा intracellular कैल्शियम की गतिशीलता को मापने के लिए एक कैल्शियम सूचक डाई के साथ RGCs लेबल करने के लिए एक कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन. विभिन्न सेलुलर डिब्बों में कैल्शियम संकेत के लिए अलग VGCCs का योगदान उप प्रकार विशिष्ट सीए चैनल ब्लॉकर्स के उपयोग के साथ अलग किया जा सकता है.
शायद यहाँ वर्णित कैल्शियम इमेजिंग तकनीक का सबसे अधिक लाभकारी पहलुओं में से एक एक साथ और स्वतंत्र रूप से कई RGCs और उनके axons से रिकॉर्ड करने की क्षमता है. इस तरह पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के रूप में कई शारीरिक तकनीक, उच्च अस्थायी समाधान झिल्ली धाराओं की रिकॉर्डिंग, दैहिक या thes के axonal स्रोत प्रदान करते हैंदर्ज ई धाराओं भेदभाव नहीं किया जा सकता और रिकॉर्डिंग एक बार में केवल एक न्यूरॉन से बनाया जा सकता है. Multielectrode सरणियों (MEAS) एक साथ कई कोशिकाओं से spikes रिकॉर्डिंग करने में सक्षम हैं, लेकिन पता लगा है और न ही की सक्रियता भेदभाव, कैल्शियम चैनल के उदाहरण के लिए, विभिन्न उपप्रकार कर सकते हैं भी नहीं. Preferentially बड़े spikes 9 उत्पन्न कि कोशिकाओं से एक दिया इलेक्ट्रोड 8 और रिकॉर्ड के करीब निकटता में स्थित हैं कि कोशिकाओं से रिकॉर्ड Meas. ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों एकल कक्ष microelectrode और पैच दबाना रिकॉर्डिंग और विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग से प्राप्त जानकारी के साथ एकीकृत किया जा सकता है कि कोशिकाओं की पूरी आबादी का एक साथ और स्वतंत्र रिकॉर्डिंग सक्षम करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करते हैं. यहाँ वर्णित कैल्शियम इमेजिंग तकनीक RGCs के कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, पैच दबाना और Meas भी आगे आयनिक धाराओं और RGCs के spiking गुणों को स्पष्ट करने के लिए समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता है.
<pवर्ग = "jove_content"> विस्थापित amacrine कोशिकाओं 10 रेटिना माउस में नाड़ीग्रन्थि सेल परत में neuronal जनसंख्या का लगभग 60% है के बाद से, हमारे लक्ष्य के चुनिंदा एक में एक सिंथेटिक कैल्शियम सूचक डाई के साथ RGCs लेबल है कि एक लोडिंग तकनीक का उपयोग किया गया wholemount तैयारी. सिंथेटिक कैल्शियम सूचक रंजक intracellular कैल्शियम की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करते हैं, इसके व्यापक उपयोग को प्रभावी ढंग से एक दिया नेटवर्क में न्यूरॉन्स की विशिष्ट आबादी को लोड करने में असमर्थता द्वारा बाधा कर दिया गया है. इस तरह के थोक लोड हो रहा है 11 और electroporation 8,12 के रूप में कई तकनीकों कोशिकाओं की पूरी आबादी, हालांकि, इस तरह की तकनीक विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेदभाव नहीं करते लोड करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. आनुवांशिक रूप से कैल्शियम संकेतक चुनिंदा कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी लेबल करने की क्षमता प्रदान करते हैं इनकोडिंग, हालांकि, इस तरह के तरीकों ट्रांसजेनिक जानवरों की 13 पीढ़ी की आवश्यकता होती है. हमारी तकनीक एक metho का वर्णनडी चुनिंदा एक कैल्शियम सूचक डाई का ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप इंजेक्शन के माध्यम से wholemount तैयारी में RGCs लेबल करने के लिए.साथ में ले ली, इस आलेख में दिए गए संरचनात्मक और शारीरिक तकनीक RGCs और उनके axons में स्थानीयकरण और कैल्शियम संकेत को VGCCs के योगदान का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
1) Immunohistochemistry रेटिना wholemounts में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को Fluo-4 स्थानीयकरण दिखाने के लिए, और 2) कैल्शियम इमेजिंग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons में कैल्शियम की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए: इस लेख म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल के योगदान के लिए डॉ एस स्टेला और हेलेन Vuong धन्यवाद. हम साक्षात्कार के दृश्य फिल्माने के लिए डॉ लालकृष्ण शीट्स धन्यवाद. हम पांडुलिपि पर उसकी टिप्पणी के लिए डॉ एरलीन Hirano धन्यवाद. इस अनुसंधान और विकास परियोजना टेलीमेडिसिन और उन्नत प्रौद्योगिकी यूसीएलए मेडिसिन में दाऊद Geffen स्कूल में लेखकों द्वारा आयोजित किया गया था और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (USAMRMC) द्वारा सम्मानित किया गया और प्रशासित किया गया था कि एक अनुबंध समझौते से संभव बनाया है और अनुबंध संख्या के तहत एमडी किले Detrick में अनुसंधान केंद्र (TATRC),: W81XWH-10-2-0077. इन अध्ययनों के लिए समर्थन भी एनआईएच EY04067 और एक वीए मेरिट समीक्षा (नो बॉल) से आया है. एनसीबी एक VA कैरियर रिसर्च साइंटिस्ट है.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
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