Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision
Summary
Protokolle für die einzelnen Neurons mikrofluidischen Anordnungs und Wasser für die Maskierung in dem Chip Plasma Strukturierung der Biomaterial-Beschichtungen beschrieben. Sehr verbunden Co-Kulturen können mit minimalem Ein-Zelle hergestellt werden.
Abstract
Mikrofluidik-Ausführungsformen der Campenot Kammer haben großes Interesse aus der Neurowissenschaften angezogen. Diese miteinander verbundenen Co-Kultur-Plattformen verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu untersuchen, Spanning Entwicklungs-und Funktions Neurobiologie, um Infektionen und Krankheiten Ausbreitungs werden. Herkömmliche Systeme benötigen jedoch erheblichen Zell Eingänge (viele Tausende pro Fach), für das Studium geringer Menge Zellen unzureichend, wie primäre dopaminergen Substantia nigra, Spiralganglien und Drosophila melanogaster Neuronen und unpraktisch für die Hochdurchsatz-Experimente. Die dichten Kulturen sind auch sehr lokal verstrickt, mit wenigen Auswüchse (<10%), die die beiden Kulturen. In diesem Papier einfach mikro-und Musterprotokolle beschrieben, die diese Herausforderungen anzugehen: (i) eine mikrofluidische einzelnen Neurons Anordnungsverfahren, und (ii) eine Wassermaskierungsverfahren für Plasma-Strukturierung Biomaterial Beschichtungen auf register Neuronen und fördern Auswuchs zwischen den Abteilen. Minimalistische neuronalen Co-Kulturen wurden mit High-Level (> 85%) intercompartment Konnektivität bereit und kann für hohe Durchsatz Neurobiologie Experimente mit einzelnen Zelle Präzision verwendet werden.
Introduction
Nervengewebe ist sehr komplex; eine heterogene Zellmischung, die räumlich in definierten Schichten und Fächer und mit Kunststoff-Konnektivität über Zell-Kontakte und vor allem über Axon und Dendriten Auswüchse bestellt wird. Neue Techniken sind erforderlich, um mehr experimentelle Freiheit, tiefere Einblicke und entwirren zentralen Mechanismen der Krankheit, Entwicklung und gesunde Funktion gewinnen verleihen. Die Campenot Kammer 1,2 und kürzlich mikroAusführungs 3,4 kann für die ex vivo Herstellung von vernetzten neuronalen Co-Kulturen mit der Fähigkeit, ihre Neuriten Auswüchse selektiv stören die verschiedenen somatischen Populationen und auch verwendet werden. Diese mikrofluidischen Bauteilen haben beispielsweise verwendet, um Axon-Degeneration und Regeneration zu studieren folgenden chemischen 5,6 oder Laser-Axotomie 6-8, Tauopathie 9, virale Verbreitung 10,11, und mRNA-Lokalisierung in Axone 4.
ent ">Um die Reichweite der Neurobiologen erstrecken, sind technologische Entwicklungen erforderlich, um minimalistische neuronalen Co-Kulturen vorzubereiten. Dies ermöglicht die Herauslösung des neuronalen Netzes für die Ermittlung des Systems mit einzelnen Zelle und subzellulären Präzision. Die Anforderung für eine minimale Zellzahlen eröffnet die Möglichkeit, seltenen Zelltypen, einschließlich dopaminergen Substantia nigra-Zellen relevant Parkinson, Spiralganglien aus dem Ohr, peripheren Neuronen zu analysieren, und Stammzellen. Darüber hinaus ist Mobilwirtschaft, die für die 3R-Initiative. Mit Hilfe dieser Mikrofluidik-Plattformen, große Bildschirme Toxizität oder andere Hochdurchsatz, können die Daten reichen Versuchsreihen, die Tier Neuronen betrachtet.
In diesem Papier Protokolle für die Herstellung und Verwendung einer Mikrofluid-Vorrichtung beschrieben. Mikrofluidik-Anordnungs in Kombination mit einem in situ Biomaterialienal Musterungsverfahren können für die Registrierung von hochvernetzten neuronalen Co-Kulturen mit minimalem Zellzahlen verwendet werden. Mikrofluidik-Anordnungs auf einem Differenzstrom-Ansatz 12-15, wobei mikro Traps in einem Fluidkreis (mit REM-Bildern in Fig. 1 dargestellt) auf der Basis positioniert. Der Pfad 0 → 1 die untere fluidische Widerstand (R 2> R 1) zum Transportieren Neuronen zu einer linearen Anordnung von mikrostrukturierten Öffnungen – die Einlässe zu den Neuriten-Auswuchs-Kanälen. Belegung der Falle durch eine einzelne Zelle lokal behindert den Durchfluss auf die Stromlinien zum Einfangen nachfolgenden Zellen in benachbarten Fallen abzulenken. Vollständige Belegung der Fallen in der Anordnung schaltet das fluidische Verhältnis (R 1> R 2), um die Stromlinien in den Serpentinenpfad (0 → 2) umzuleiten, um eine Bypass-Betriebsmodus für die Entfernung von überschüssigem Neuronen zu erzeugen.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Abbildung 1. Mikrofluidik-Circuit. A) Die differentielle Widerstand Fluidkreis für einzelnes Neuron Anordnungs, mit flankierenden Kulturkammern von Neuritenwachstum Kanäle miteinander verbunden. B, C) SEM-Bilder der Doppelschicht compartmentalized Neuron Co-Kultur-Array mit Meniskus Pinning Mikrosäulen. Mit diesem Entwurf wurden Dreizack-förmigen Neuron Fangstrukturen verwendet, um Faszikulation der Neuriten Auswüchse zu fördern. Abbildung und Legende mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) wiedergegeben 12. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Die Herstellung von mikro neuronaler Netzwerke auf ebenen Substraten kann leicht erreicht werden (exampl es aus unserer Gruppe finden Frimat et al. 16 und Heike et al. 17). Allerdings Verkapselung bioaktiven Material Muster in PDMS-Geräten und mit der Anforderung des Mikrometer-Skala Ausrichtung der diese den mikrofluidischen Kanälen stellt eine große technische Herausforderung. In Abschnitt 3.1 wird ein Protokoll für die in dem Chip oder in situ Herstellung von Biomaterial-Muster dargestellt. Diese Muster ermöglichen Neuron Anmeldung bei längeren Zeitskalen und Kultur zu fördern Auswüchse zwischen Fächern. Meniskus-Pinning Mikrostrukturen verwendet werden, um eine so genannte Wasser-Maske mit dem Neuron Anordnen Sites und Neuritenwachstum Kanälen auszurichten. Das Wasser Maske schützt Adhäsionsmolekül Beschichtungen während der Plasmabehandlung, während exponierten Flächen werden aufgelöst, das Biomaterial Muster definieren. Zusätzlich sind Protokolle für die Zellkultur und für die fluidische Trennung für die selektive Behandlung der verschiedenen Co-Kultur Kammern notwendig ist.
ve_content "> Die Protokolle sind auf die benutzerfreundliche Prinzipien der Softlithographie für die Replikation von Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen 18 zu nutzen. Auch in situ Biomaterial Musterung ist einfach, die Nutzung Verdunstung und Oberflächenspannung Phänomene und nur erfordern eine preiswerte Hand-Plasmaquelle. Mikrofluidik-Schaltung effektiv Programme Zelle Laderaum und spezielle Behandlungen machen diese Operationen nur eine Frage der Abgabe von Materialien in die richtige unteren Anschluss und Absaugen von oben. Auf diese Weise beabsichtigt ist, die Neurobiologen geben die Freiheit, in den eigenen Labors herzustellen und zu verwenden mikrofluidischen Bauteilen.Protocol
Representative Results
Discussion
Die mikrofluidische Anordnungs Technik ist die erste ihrer Art, die Präzision einzelnen Neurons Handhabung für die Einrichtung minimalistisch Kulturen ermöglicht. Mit der in-situ-Biomaterial-Strukturierungsverfahren, einem leistungsfähigen Ansatz zur Zellmuster mit mikrofluidischen Strukturen auszurichten Gekoppelt sind diese minimalistischen Kulturen Hoch intercompartment Connectivity-Level mit eingeschränkter lokale Verschränkung. Diese Merkmale können für die effiziente Untersuchung von interFach Üb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar, dass Ulrich Marggraf (ISAS) für SU-8-Herstellung und Maria Becker (ISAS) für SEM-Bildgebung. Die Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), ein Bundesministerium für Bildung und Forschung Zuschuss (BMBF 0101-31P6541) und vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen unterstützt. Heike Hardelauf dank der Internationale Leibniz Graduate School "Systems Biology Lab-on-a-Chip" für finanzielle Unterstützung.
Materials
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | |||
| Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum Dessicator or Centrifuge |
Referências
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
- Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J. -. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
- Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
- Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
