Neuronal vävnad är mycket komplexa; en heterogen cellblandning som rumsligt beställs inom definierade lager och fack och med plast anslutning via cellkontakter och speciellt via axon och dendrit utväxter. Nya tekniker behövs för att ge ökad experimentell frihet att få djupare insikter och avslöja mekanismer centrala för sjukdomen, utveckling, och friska funktion. Den Campenot kammare ^1,2 och mer nyligen mikrofabricerade utföringsformema ^3,4 kan användas för ex vivo-framställning av nätverks neuronala samkulturer med förmågan att selektivt störa de olika somatiska populationer och även deras neurite utväxter. Dessa mikroflödessystem enheter har till exempel använts för att studera axon degeneration och regeneration följande kemiska ^5,6 eller laser axotomy ^6-8, tauopathy ^9, viral spridning ^10,11, och mRNA-lokalisering i axoner ^4.

ent ">

För att utöka räckvidden för de neurobiologists, är den tekniska utvecklingen som krävs för att förbereda minimalistiska neuronala co-kulturer. Detta möjliggör lösgörande av det neuronala nätverket för undersökning av det system med enskild cell och sub-cellulära precision. Kravet på minsta cell nummer öppnar möjligheten att analysera sällsynta celltyper, inklusive dopaminerga substantia nigra celler relevanta för Parkinsons sjukdom, spiral ganglier från örat, perifera nervceller, och stamceller. Utöver detta, är cellulära ekonomi relevans för 3R-initiativet. Med hjälp av dessa mikroflödes plattformar, toxicitet skärmar storskaliga eller annan hög genomströmning kan data rika försöksserier som kräver djur nervceller nu beaktas.

I detta papper protokoll för tillverkning och användning av en mikrofluidanordning beskrivs. Microfluidic ordnande i kombination med en in situ biomaterial mönstring metod kan användas för registrering av starkt sammankopplade neuronala co-kulturer som använder minimal cell nummer. Microfluidic grupperings är baserad på en differentialflödes metod ^12-15, varvid mikrostrukturerade fällor är placerade inom en fluidkrets (illustrerad tillsammans med SEM-bilderna i fig 1). Vägen 0 → 1 har den nedre fluidic motståndet _{(R2> R1)} för transport av nervceller till en linjär grupp av mikrostrukturerade öppningar – inloppen till de neuritutväxt kanalerna. Inflyttning i fällan av en enda cell lokalt hindrar flödet för att avleda de effektiviserar för att fånga efterföljande celler i grann fällor. Komplett beläggning av fällorna i arrayen växlar fluidic förhållandet _{(R1> R2)} för att avleda de strömlinjerna i den slingrande väg (0 → 2) för att producera en bypass driftsform för att avlägsna överskott av nervceller.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid">
Figur 1. Microfluidic Circuit. A) Den differentiella motstånd fluidkrets för enda neuron grupperings, med flankerande odlingskamrarna är sammankopplade av neuritutväxt kanaler. B, C) ​​SEM-bilder av dubbelskiktet compartmentalized neuron samodling array med menisk pinning micropillars. Med denna konstruktion var treudd formade neuron fångst strukturer användas för att främja fascikulering av neurite utväxter. Bild och legend återges med tillstånd av Royal Society of Chemistry (RSC) ^12. Klicka här för att visa en större bild.

Beredningen av micropatterned neuronala nätverk på plana underlag kan lätt uppnås (för exampl es från vår grupp, se Frimat et al. ¹⁶ och Heike et al. ^17). Men kapsla in bioaktiva materialmönster inom PDMS-enheter och med kravet på mikrometerskala anpassning av dessa till mikroflödessystem kanaler innebär en stor teknisk utmaning. I avsnitt 3.1 ett protokoll för i-chip, eller in situ, beredning av biomaterial mönster presenteras. Dessa mönster aktivera neuron registrering under långa kulturtidsramar och främja utväxter mellan fack. Menisk-pinning mikrostrukturerna används för att rikta in ett så kallat vatten mask med neuronen grupperande platser och neuritutväxt kanaler. Vattnet mask skyddar adhesionsmolekyl beläggningar under plasmabehandling, medan exponerade ytor sönderdelas för att definiera biomaterial mönstret. Dessutom är protokoll tillhandahålls för cellodling och för fluidic isolering är nödvändig för selektiv behandling av de olika sam-odlings fack.

ve_content "> är De protokoll som syftar till att utnyttja de användarvänliga principer för mjuk litografi för replikering av poly (dimetylsiloxan) (PDMS) mikrofluidikanordningar ^18. På samma sätt, in situ biomaterial mönstring är okomplicerad, utnyttja avdunstning och ytspänning fenomen, och endast kräver en billig handhållen plasmakälla. Den mikroflödeskretsen effektivt program cell lastning och fack specifika behandlingar gör dessa operationer bara om att fördela material i rätt nedre porten och aspire ovanifrån. På detta sätt den är avsedd att ge neurobiologists friheten att förbereda och använda mikroflödessystem enheter i sina egna laboratorier.