生物层干涉测量的蛋白质 - 蛋白质相互作用和变构配体反应动力学的影响

蛋白质-蛋白质相互作用是重要的，许多生物过程和无标记光学方法，如表面等离子体共振（SPR）已被用于在体外研究的结合和解离动力学^1。大多数无标记方法固定在传感器表面1的生物分子，并使用一个光信号，从溶液中检测结合配偶体，因为它与固定的生物分子¹相关联。而SPR是一种高度灵敏的方法，很容易产生干扰的变化导致流过传感器²的溶液的折射率。虽然不如SPR，生物层干涉测量（BLI）作为敏感较少受样本结构改变^1,3。 BLI使用具有在前端的专有生物相容性涂层光纤生物传感器。这里使用（八位-RED96）系统包含八个分光光度计。白光通过管道输送到某行上移动机械臂探头。光纤传感器ARË拾起探头和转移到含有样品96孔板。一种靶分子被固定在生物传感器表面。然后传感器被移动到包含在溶液中的结合配偶体的孔中。劳保局监察与固定化分子的结合合作伙伴的关联，然后移动传感器解决方案，而约束力的合作伙伴后，监控解离。分子结合到生物传感器表面导致其反射回分光光度仪从内部表面和从传感器和溶液之间的外部接口的光波之间的变化的光学干涉。这些变化中的干扰可以被量化，并用于确定结合和解离，总结在图1所示的动画动力学速率。

我们已申请BLI测量细菌ATP合酶的催化复杂，其ε亚基，它可以自动抑制酶之间的相互作用。 ATP学年nthase是膜嵌入旋转纳米发动机，其催化合成与ATP的水解^4。该催化复合物（F _1）可以分离的，因为可以作为一个ATP酶的可溶形式。亚基ε具有两个结构域：N-末端结构域（NTD）是必要的适当组件和所述酶的功能性偶联，但不直接与催化亚基相互作用;的C-末端结构域（CTD）可以通过与相互作用抑制酶多重催化亚基^5,6。这ε-介导的调控是针对细菌的ATP合成酶和线粒体同源没有观察到。 ATP合酶已经成为了抗菌药物的目标，如由bedaquiline治疗耐药结核病⁷近期FDA的批准。因此，靶向药物发现ε的抑菌作用可能产生抗菌素不抑制线粒体ATP合酶。与孤立的催化性复合物（F _1），ε成为一个可分离的亚基。然而，随着ε绑定到F _1，εCTD可经历戏剧性的构象变化，部分地插入到酶的中央空腔，并形成有抑制作用的状态是不太可能直接^6,8解离。我们使用BLI测量F ₁ /ε结合和解离动力学，间接，审查的催化位点配体对ε的构象变构效应。

在我们的系统中，ε自BLI信号（如SPR）被选择用于固定在传感器表面上是对分子的表面结合的质量敏感。 ε亚基是小（约15 kDa）的相对于所述主F ₁复合物（〜347 kDa）的。从而，一个更大的BLI信号将导致选自F ₁的结合固定化的ε。为了监测F ₁的解离，它可以是非常慢，ε必须被牢固地固定。因此，我们选择了生物素化以及它固定在链亲和素包被的生物传感器。蛋白质可以通过（i）随机修饰表面的赖氨酸⁹的，用生物素-马来酰亚胺试剂¹⁰或（iii）基因中加入特定的生物素受体 ​​肽，它是在酶促生物素化的独特的天然或改造的半胱氨酸（II）的反应是生物素化在标签的蛋白¹¹的体内表达。在我们的系统中，ε是用方法^（ⅲ）8生物素化。一旦生物素标记的ε固定在链霉亲和传感器，劳保局可以测量的结合和F ₁的解离已耗尽亚基ε（F _{1（-ε））}的。对于这里描述的实验中，初步试验已经完成，以确定合理的量的生物素化的蛋白质与固定在传感器上。这可以有所不同，这取决于蛋白质的分子量和其结合配偶体，但目标是确定的固定化蛋白质吨最小量帽子（i）提供可接受的信号与噪声的结合动力学与结合配偶体（下面_杀敌D）的低浓度和结合动力学与结合配偶体的附近的饱和浓度（ⅱ）最小的失真。此外，生物素化的化学计量可能会有所不同（但要避免> 1摩尔生物素/摩尔蛋白），所以一些初步的分析可能需要为每一批新的生物素化的蛋白质，以确认一致劳保局信号可以固定化过程中实现对链霉亲和涂层传感器。