Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em> In Vivo</em
Summary
Due fotoni di imaging, accoppiato ad nanodissection laser, sono strumenti utili per studiare processi degenerativi e rigenerativi nel sistema nervoso centrale con risoluzione subcellulare. Questo protocollo viene illustrato come etichetta, immagine e sezionare singole fibre di arrampicata nella corteccia cerebellare in vivo.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
Transezione assonale derivanti da lesioni meccaniche, insulto tossico o malattie neurodegenerative è di solito seguita da degenerazione della parte distale dell'assone che si stacca dal corpo cellulare 10-13. Con poche eccezioni 2,7,14,15, assoni mozzate nel sistema nervoso centrale degli animali adulti di solito sono in grado di attivare un programma di ricrescita 16.
Poco si sa circa le dinamiche in tempo reale di eventi degenerativi a livello cellulare e subcellulare. Lo sviluppo di nuove strategie per limitare il danno neuronale e promuovere la ricrescita neuronale richiede, come primo passo, chiarire il meccanismo con cui le cellule neuronali singolarmente feriti degenerano e rigenerano. Questo studio è più direttamente indirizzata monitorando le dinamiche di un singolo neurone in vivo. Mentre le tecniche di un fotone di imaging di fluorescenza sono limitati dalla intensa diffusione della luce visibile, eccitazione a due fotoni raggiunge profondi strati corticali in live mouse con subcellulare risoluzione di 3,4,17. Approfittando di topi transgenici in cui proteine fluorescenti sono selettivamente espressi in sottopopolazioni di neuroni 18-20, microscopia TPF è stato applicato alla esplorazione di plasticità sinaptica e allungamento assonale durante lo sviluppo in vivo 21,22. L a capacità di neuroni singolarmente danneggiate ricrescere dopo l'infortunio può essere indagata mediante accoppiamento nel monitoraggio vivo da due fotoni di imaging con un modello di danno specificamente mirato al assone di interesse. Assorbimento multi-fotone di impulsi a femtosecondi è stato usato per distruggere singoli dendriti o anche singole spine 5,23. Inoltre, questo paradigma lesioni permette di tagliare rami singoli assonale senza interrompere il dendrite contattando 6. Nel contesto di sezionare le caratteristiche che permettono specifica popolazione neuronale per rigenerare i loro assoni, le fibre di arrampicata cerebellari una volta danneggiati (CFS) sono un modello SI utilence conservano notevoli proprietà plastiche dopo l'infortunio anche negli animali adulti 24,25. Recentemente, imaging a lungo termine di CFS ha mostrato che questi assoni sono in grado di ricrescita nei giorni successivi assotomia laser 6.
Questo protocollo descrive come etichettare i neuroni olivocerebellar e il loro allungamento assonale attraverso anterograda tracing. Una volta che i neuroni di interesse sono fluorescente, possono essere monitorati ripetutamente in momenti arbitrari per settimane o mesi in una finestra del cranio. La procedura di sezionare singoli rami assonali da assotomia laser in vivo verrà illustrato.
Le tecniche qui presentate offrono nuove intuizioni nel meccanismo di rimodellamento assonale in vivo e possono aiutare lo sviluppo di strategie terapeutiche per limitare la degenerazione neuronale e promuovere la ricrescita assonale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo mostra come etichettare neuroni dell'oliva inferiore con un colorante fluorescente. Successivamente, il metodo per eseguire una finestra del cranio sulla corteccia cerebellare è descritto. Questa tecnica fornisce accesso ottico alla porzione terminale dei neuroni olivocerebellar, le fibre rampicanti. Purtroppo, il risultato sia di etichettatura e chirurgia craniotomia è piuttosto basso anche nelle mani di operatori specializzati (di solito 1 su 3 topi è etichettato, e 1 su 3 finestre cranici res…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
Referências
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