Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel
Summary
Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.
Abstract
Het wordt steeds duidelijker dat de neurotransmitter receptoren, waaronder ionotrope GABA A-receptoren (GABAAR), vertonen zeer dynamische handel en celoppervlak mobiliteit 1-7. Om receptoroppervlak cel lokalisatie en endocytose bestuderen, de hier beschreven techniek combineert het gebruik van TL-α-bungarotoxin met cellen die constructen die een α-bungarotoxin (SW) bindingsplaats (BBS). De BBS (WRYYESSLEPYPD) is gebaseerd op de α-subeenheid van de spier nicotine acetylcholine receptor, die Bgt bindt met hoge affiniteit 8,9. Opneming van het BBS site kan oppervlak lokalisatie en metingen van receptor inbrengen of verwijderen onder toepassing van exogeen fluorescente Bgt, zoals eerder beschreven in het volgen van GABAA en GABAB metabotrope receptoren 2,10. Naast de BBS plaats, hebben wij een pH-gevoelige GFP (pHGFP 11) tussen aminozuren 4 en 5 van het rijpe GABAAR subeenheid van standaard molecular biologie en PCR klonering strategieën (zie figuur 1) 12. De BBS 3 'van de pH-gevoelige GFP reporter, gescheiden door een 13-aminozuur alanine / proline linker. Voor verhandelen studies in deze publicatie die gebaseerd zijn op gefixeerde monsters beschreven, de pHGFP dient als een reporter totale gelabeld GABAAR subeenheideiwit niveaus, zodat normalisatie van de Bgt gemerkte receptor populatie totale receptor populatie. Dit minimaliseert cel om Bgt vlekken signaal variabiliteit als gevolg van hogere of lagere baseline expressie van het tagged GABAAR subeenheden cel. Verder is de pHGFP tag maakt een eenvoudige identificatie van construct tot expressie brengen van levende of vaste imaging experimenten.
Introduction
Het gebruik van fluorescent gekoppelde α-bungarotoxine receptor lokalisatie en dynamica studie is ontwikkeld in studies van de nicotine acetylcholine receptor 13-15, het toxine endogene doelwit. Vervolgens heeft incorporatie van de minimale Bgt bindend peptide (BBS) is gebruikt om de handel van zowel prikkelende en remmende ligand-gated ionkanalen en G-eiwit gekoppelde receptoren 2,10,16-21 bestuderen. Dit BBS-gebaseerde techniek biedt voordelen voor andere benaderingen gebruikt voor mensenhandel studies zoals oppervlakte biotinylatie methoden, antilichaam etikettering van levende cellen met antilichamen tegen extracellulaire epitopen, en fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP). Tijdens celoppervlak biotinylatie vrije amines covalent gemodificeerd, met de potentie om cellulaire activiteit beïnvloeden. Antilichamen gebaseerde studies vaak gehinderd door oppervlakte-antigeen clustering of aftopping, die handel gebeurtenissen kan veranderen. Door het bleken stap FRAP studies, een belangrijke zorg is beschadiging van de onderliggende cellulaire structuur. Een bijkomend voordeel is dat BBS gemerkte constructen kunnen ook worden gebruikt voor biochemische methodologieën met biotine gekoppeld bungarotoxin om te beoordelen receptor handel. Deze techniek is direct voor cellijnen en primaire cellen. Voor gebruik in cellen die nicotine acetylcholine (nAChR) receptoren, moet de nAChR antagonist tubocurarine het hele protocol gebruikt worden zoals aangegeven. Het uitvoeren van een eenvoudige oppervlak Bgt labeling (gelijk aan T = 0 tijdstip voor de endocytose Protocol) op getransfecteerde cellen in de afwezigheid van tubocurarine zal bewijzen endogene nAChR verschaffen.
Een belangrijke overweging voor deze techniek is geschikt inbrengen van de BBS zodat was aanwezig op een extracellulaire locatie wanneer het eiwit van interesse wordt aan de plasmamembraan. Bijvoorbeeld, de N-eindstandige domeinen van GABAAR subeenheden in de vesiculaire lumen bevinden tijdens TRAFficking en word extracellulaire receptor na inbrengen in de plasmamembraan, waardoor specifieke etikettering van celoppervlak receptoren en beoordeling van hun verwijdering uit het celoppervlak door endocytisch evenementen. We hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van GFP, myc of BBS epitopen dit domein GABAAR subeenheden functioneel stil. Standaard controles moeten worden uitgevoerd zodat de gecodeerde eiwit tot expressie op niveaus vergelijkbaar met een niet-gecodeerd construct, dat het een goed gelokaliseerd en dat het geen invloed receptorfunctie. Deze karakterisering van getransfecteerde constructen zal ook helpen bij het oplossen van problemen overexpressie zorgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De BBS gebaseerde vaste en levende technieken die hier beschreven kan worden gebruikt om receptor of andere plasmamembraaneiwit handel in cellijnen, neuronen en andere primaire cellen te volgen. Deze werkwijze is met succes gebruikt voor membraan insertie en verwijdering van ligand-gated ionkanalen en GPCR bestuderen en veranderingen in de handel deze door de aanwezigheid van receptor agonisten en modulatoren. Belangrijke aspecten bevatten passende lokalisatie van het label om een extracellulaire locatie en het ui…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteuning werd verleend door startup-fondsen van de biologie afdeling Farmacologie en Chemical aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine. Erkenning van Jacob lab-leden die naar de homevideo bijgedragen: Nicholas Graff.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
Referências
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , (1998).
