Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için
Summary
Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir.
Abstract
Beyin korteksi, birlikte bir ağ olarak karar verme, duyusal kılavuzlu davranış veya bellek dahil olmak üzere birçok yüksek bilişsel işlevler sorumludur çok katmanlı ve çok farklı hücre tipleri ile karakterize edilir. Böyle karmaşık nöronal ağlar gibi görevleri gerçekleştirmek nasıl anlamak için, çok önemli bir adımdır hayvan ilgili bir bilişsel görevi gerçekleştirirken zaman tercihen, ağ içinde tek tek hücre tiplerinin işlevini (veya elektriksel aktiviteyi) belirlemektir. Ayrıca, ters kortikal ağını sağlamak için bireysel nöronların ağ ve morfolojik mimarisinin anatomik yapısını belirlemek için eşit derecede önemlidir. Bugün mevcut teknik atılımlar kaydedildi nöronları belirlenmesi post hoc değerli seçeneği ile hayvanlar davranmak, uyanık hücresel aktiviteyi kayıt izin. Burada, biz kayıt eylem potenti içerir juxtasomal biocytin etiketleme tekniği, göstermekal geleneksel yama pipetler kullanılarak dışı (ya da gevşek-yama) konfigürasyonunda spike. Juxtasomal Kayıt konfigürasyon, anestezi sedasyon, uyanık kafa sabit, ve hatta serbestçe hareket hayvanda dahil, davranışsal koşulları karşısında nispeten istikrarlı ve uygulanabilir. Bu yüzden, bu yöntem, bireysel nöronlar ve sonuçta, tüm kortikal mikrodevre yeniden hayvan davranış sırasında hücre tipi özel aksiyon potansiyeli çapalama bağlama sağlar. Bu Video yazıda, juxtasomal yapılandırmada bireysel nöronların post hoc tanımlanması ve morfolojik yeniden inşası için üretan-anestezi sıçan biocytin ile etiketlenmiş nasıl göstermektedir.
Introduction
Nöronal ağ oldukça spesifik morfolojik ve fizyolojik özellikleri 1-7, özelliği çok sayıda hücre türleri, oluşur. Bunun bir sonucu olarak, tek tek hücre tipleri (bakınız örneğin Gentet et al. 8 ve Burgalossi et al. 9) ağ içinde özel görevleri yerine getirir. Biz sadece nöronal ağlarda hücre tipine özel işlevleri anlamaya başlıyor ve çok keşfedilmeyi hala. Bu amaçla, çok sayıda laboratuarlar fizyolojik parametre 1,10-15 elde edilmiş olan aynı nöronal nüfusun morfolojik özelliklerinin analizine izin deneysel yaklaşımlar uygulamaktadır. Burada, biocytin ile kaydedilen nöronun elektroporasyon ile kombinasyon halinde hücre dışı (böylece invazif olmayan) bir yapılandırmada geleneksel kumanda pipetler kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları içerir juxtasomal etiketleme tekniği 16,17 gösterir.Bu yaklaşımın önemli bir avantajı, invaziv olmayan doğası tek nöronların aksiyon potansiyeli spike (örneğin diyaliz) hücrenin hücre içeriği değiştirmeden kaydedilir sağlar olmasıdır. Elektroporasyon ardından, juxtasomal yaklaşım yapısı (morfoloji) fonksiyonu (fizyoloji) bağlamak için post hoc hücre tanımlaması ve rekonstrüksiyon seçeneği sağlar. Tipik olarak, morfolojik yeniden omurga ve / veya bouton yoğunlukları miktarının veya elektron mikroskobu kullanılarak nm çözünürlükte nöronal morfoloji da yeniden genişletilebilir dendritik ve aksonal morfolojisi yeniden içerir. Çalışmaların çoğu, örneğin, fare ya da sıçan gibi küçük kemirgenlerde tekniği uygulanır olmasına rağmen juxtasomal kayıt tekniği, kortikal katmanları arasında türler ya da bir dizi alt kortikal bölgelerinde çeşitli hücre tiplerinin in vivo kayıtları için kullanılabilir. Bizim araştırma nöronlar kayıt ve etiketleme odaklanmıştırsıçan primer somatosensori korteks (S1) dan ve kayıtlı nöronların 18 görsel bir kimlik içerir, standart bir referans çerçevesi içinde kesin kayıt ile kombinasyon dendritik rekonstrüksiyonlar hücre tipine özel yerel karakterize etmek için kortikal ağları 4,19 ve aksonal mimarisi ayrıntılı yeniden tersine mühendislik ve uzun menzilli projeksiyon 20. hedefliyor.
Uyanık baş sabit 23, ya da serbest hareket eden hayvanlar 9, alternatif bir in vivo kayıt teknikleri (hücre içi ya da bütün hücre) ile karşılaştırıldığında, juxtasomal kayıtları nispeten kararlı olan ve bu yüzden anestezi 21,22 dahil olmak üzere davranış eyalette uygulanabilir, 14, sedasyon . Biz seçim birçok preparatlar için bu tekniğin genel uygulanabilirliğe vurgulamak rağmen Burada, bir üretan ile anestezi uygulanmış sıçan S1 juxtasomal etiketleme göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Juxtasomal yöntem davranışsal koşulları karşısında tek birimlerden vivo aksiyon potansiyeli çivilenmesi kayıt sağlar (anestezi, uyanık baş-sabit veya serbestçe hareket) biocytin-etiketleme post hoc hücre tipi sınıflandırma ve / veya 3D rekonstrüksiyon için kaydedilen nöron seçeneği ile. Büyük avantajı dışı (böylece noninvaziv) yapılandırmada fizyolojik parametrelerini elde etmek için, henüz biocytin 16,17,32 ile hücre nöron etiketlemek edememek. E…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Profs teşekkür etmek istiyorum. Kapsamlı destek için Huibert Mansvelder ve Bert Sakmann, verimli tartışmalar ve teknik yardım için nöronal izleme ve Brendan Lodder sağlamak için Dr Marcel Oberlaender. Veri cömertçe R. Bruno (Columbia Üniv., NY, ABD) tarafından sağlanan LabView için ntrode VI, kullanılarak elde edilmiştir. Bu araştırma Max Planck Derneği ve Hesaplamalı Sinirbilim, Tübingen için Bernstein Merkezi tarafından desteklenmiştir (Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (Bmbf tarafından finanse; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics ve Bilişsel Araştırma Merkezi (CNCR) , Neuroscience Kampüs Amsterdam (NKA), CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 ve ENC-Ağ # p3-c3) ve VU Üniversitesi Amsterdam fon.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
Referências
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
