Summary

Enregistrement électrophysiologique De<em> Drosophila</em> Labellar Goût Sensilles

Published: February 26, 2014
doi:

Summary

Ce protocole décrit l'enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d'action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.

Abstract

La réponse du périphérique goût des insectes peut être puissamment étudié avec des techniques électrophysiologiques. La méthode décrite ici permet au chercheur de mesurer les réponses gustatives directe et quantitative, reflétant l'entrée sensorielle que le système nerveux des insectes reçoit de stimuli du goût de son environnement. Ce protocole décrit les principales étapes de l'exécution de cette technique. Les étapes essentielles de l'assemblage d'un appareil de l'électrophysiologie, tels que la sélection de l'équipement nécessaire et un environnement approprié pour l'enregistrement, sont délimitées. Nous décrivons également comment se préparer à l'enregistrement en faisant électrodes de référence et d'enregistrement appropriés et des solutions exhausteur de goût. Nous décrivons en détail la méthode utilisée pour la préparation de l'insecte par insertion d'une électrode de référence de verre dans la volée pour immobiliser la trompe. On montre les traces des impulsions électriques alimentées par les neurones gustatifs en réponse à un sucre et d'un composé amer. Aspects du protocole sont techniquement difficile et nous incluons une description détaillée de certaines difficultés techniques communes que l'on peut rencontrer, comme l'absence de signal ou de bruit excessif dans le système, et les solutions possibles. La technique a ses limites, comme l'impossibilité de livrer stimuli temporellement complexes, observer fond de tir juste avant stimulus livraison, ou utiliser des composés de goût insolubles dans l'eau facilement. Malgré ces limites, cette technique (y compris les variations mineures mentionnées dans le protocole) est une procédure standard largement accepté pour l'enregistrement des réponses neuronales Drosophila goûter composés.

Introduction

Le sens du goût permet un insecte de détecter une vaste gamme de produits chimiques solubles et joue un rôle important dans l'acceptation d'une substance nutritive, ou le rejet d'un être nocif ou toxique. Le goût est aussi pensé pour jouer un rôle dans le choix du conjoint, grâce à la détection des phéromones 1-5. Ces fonctions importantes et diversifiées ont rendu le système de goût insecte une cible irrésistible de l'enquête sur la façon dont les systèmes sensoriels traduisent les signaux environnementaux en sorties comportementales pertinentes.

L'unité principale du système de goût de Drosophila melanogaster est le poil de goût, ou sensille. Molécules entrent dans le sensille via un pore à son extrémité 2,6. Sensilles se trouvent sur ​​le labelle, les jambes, le bord de l'aile, et le pharynx 6. Sur le labelle, le nombre et l'emplacement des sensilles est stéréotypés. Il existe trois classes morphologiques de sensilles fonction de la longueur: long (L), intermédiaire (I), et court (S ) Sensilles 7,8. Chaque sensille contient soit deux (de type I) ou quatre (L-et S-type) neurones récepteurs gustatifs (GRNS 9). Différents GRNS répondre aux différentes catégories de stimuli du goût: amer, le sucre, le sel et l'osmolarité 7,10 et expriment différents sous-ensembles de récepteurs gustatifs 8,11-13. Seulement I et de type S sensilles contiennent GRNS amères sensible 8,10. Le projet GRNS au ganglion subesophageal (SOG) et leur activation par des molécules de goût est relayé vers le système nerveux central supérieur pour le décodage, ce qui entraîne une réponse comportementale 6. Le nombre relativement faible de neurones et la susceptibilité à l'analyse moléculaire et comportementale rendre le système de goût Drosophila un excellent modèle pour l'étude des systèmes gustatives en général. La relative facilité avec laquelle le système peut être manipulé par une mutation génétique ou le système d'expression GAL4 UAS est aussi un outil précieux 14,15.

ontenu "> Parce que ces sensilla dépassent de la surface de la labellum, ils sont d'excellentes cibles pour l'électrophysiologie. L'allumage des GRNS peut être contrôlée en utilisant l'enregistrement extracellulaire. Historiquement, le procédé d'enregistrement de paroi latérale, qui utilise une électrode de verre inséré dans le sensille pour enregistrer l'activité neuronale, 26 a été la méthode d'enregistrement d'extrémité, qui mesure la réponse des neurones avec une électrode utilisée. Cependant, cette méthode est techniquement difficile à réaliser, et il est difficile d'enregistrer pendant longtemps à partir de chaque préparation. que délivre simultanément un exhausteur de goût, devenu depuis la méthode de choix 9,16. Il a été utilisé pour étudier le système de goût de Drosophila melanogaster 8,10,17,18 ainsi que d'un certain nombre d'autres espèces d'insectes 19-23. Elle a été grandement facilité par le développement de l'amplificateur tastePROBE, qui a surmonté l'un des principaux inconvénients de la méthode d'enregistrement de pointe en compensantla grande différence de potentiel entre l'électrode de référence et la sensille d'insecte, ce qui permet les potentiels d'action de GRN à être enregistrées sans amplification excessive ou de filtrage 24. Un autre développement important a été l'utilisation de tricholine citrate comme électrolyte enregistrement 25. STC supprime les réponses du GRN de l'osmolarité sensible et ne stimule pas la GRN sensible au sel, faire les réponses générées par tastants amères et le sucre beaucoup plus facile à analyser 25.

Nous décrivons ici l'enregistrement de la drosophile labellar sensilles de pointe est actuellement effectué dans le laboratoire Carlson. Ce protocole explique comment établir une plate-forme appropriée de l'électrophysiologie, la façon de préparer la volée, et la façon d'effectuer des enregistrements de goût. Nous présentons également des données représentatives obtenues par l'enregistrement de sous-ensembles de la drosophile sensilles, ainsi que certains problèmes courants et les solutions possibles qui peuvent survenir lors de l'utilisation de cettetechnique.

Protocol

Le protocole suivant est conforme à toutes les directives de protection des animaux de l'Université de Yale. Une. Réactifs et Préparation du matériel Installation de matériel d'enregistrement (figure 1A). Choisissez une chambre pour la configuration de plate-forme qui est exempte de grosses variations de température ou d'humidité et aussi isolé des sources de bruit électrique et mécanique, tels …

Representative Results

La figure 5A montre la réponse d'un L sensille à un sucre, le saccharose. Le même sensille ne répond pas à un composé amer, la berbérine. Figure 5B montre que l'sensille de type I, qui contient un neurone sensible amer, affiche de plus grands pics d'amplitude en réponse à la berbérine, et de plus petites pointes d'amplitude en réponse au saccharose. L sensilles afficher une réponse de fond minimale pour le contrôle solvant, TCC, alors que je sensilles affich…

Discussion

Sensilla Labellar varient dans la facilité d'enregistrement en raison de différences de morphologie et de l'organisation anatomique. Parfois, un sensille ne répond pas à toutes les substances sapides, même celui qui est connu pour déclencher une réponse positive. La fréquence à laquelle cela se produit varie en fonction du type sensille. L sensilles sont les plus constamment réceptifs et sont relativement faciles d'accès en raison de leur longueur. En général, S sensilles sont toujours sensibles…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de 1F31DC012985 prédoctorale NRSA (à RD) et par des subventions du NIH à JC

Nous tenons à remercier le Dr Weiss Linnea des commentaires utiles sur le manuscrit, le Dr Ryan Joseph pour aider les compiler les chiffres, et le Dr Frédéric Marion-Poll pour des conseils techniques utiles. Nous tenons également à remercier les précieux commentaires de quatre auteurs.

Materials

Stereo Zoom Microscope Olympus  SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand
Anti-vibration Table Kinetic Systems BenchMate2210
Micromanipulators Narishige NMN-21
Magnetic stands ENCO Model #625-0930
Reference Electrode Holder Harvard Apparatus ESP/W-F10N Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range
 Silver Wire World Precision Instruments AGW1510 0.3-0.5mm diameter
Retort Stand generic
Outlet Plastic Tube generic, 1cm diameter
Flexible Plastic Tubing Nalgene  8000-0060 VI grade 1/4 in internal diameter 
500 ml Conical Flask generic,  with side arm
Aquarium Pump Aquatic Gardens Airpump 2000
Fiber Optic Light Source Dolan-Jenner Industries Fiber-Lite 2100
White Card/Paper Whatman 1001-110
Digital Acquisition System Syntech IDAC-4 Alternative: National Instruments NI-6251  
Headstage Syntech DTP-1 Tasteprobe
Tasteprobe Amplifier Syntech DTP-1 Tasteprobe
Alligator Clips Grainger 1XWN7 Any brand is fine
Insulated Electrical Wire Generic
Gold Connector Pins World Precision Instruments 5482
Personal Computer Dell  Vostro Check for compatibility with digital acquisition system and software
Acquisition Software Syntech Autospike Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251
Aluminum Foil and/or Faraday Cage Electro-magnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller
Beadle and Ephrussi Ringer Solution See recipe in protocol section
Tricholine citrate, 65%  Sigma T0252-100G
Stereo Microscope Olympus VMZ 1x-4x Capable of 10x-40x magnification
Ice Bucket Generic
p200 Pipette Tips Generic
Spinal Needle Terumo SN*2590
1ml Syringe Beckton-Dickenson 301025
Fly Aspirator Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay Generic
Forceps Fine Science Tools By Dumont 11252-00 #5SF (super-fine tips)
10ml Syringe  Beckton-Dickinson 301029
Plastic Tubing Tygon R-3603

Referências

  1. Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
  2. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
  3. Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
  4. Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
  5. Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
  6. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
  7. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
  8. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
  9. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
  10. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
  12. Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
  13. Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
  15. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
  16. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
  17. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
  18. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
  19. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
  20. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of “bitter” taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
  21. Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
  22. Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
  23. Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
  24. Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. a. n. Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
  25. Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
  26. Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
  27. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
  28. Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
  29. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
  30. Axon Instruments. . The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
  31. Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
  32. Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
  33. Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
  34. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
check_url/pt/51355?article_type=t

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Citar este artigo
Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla. J. Vis. Exp. (84), e51355, doi:10.3791/51355 (2014).

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