تسجيل الكهربية من<em> ذبابة الفاكهة</em> Labellar طعم الشعيرات
Summary
يصف هذا البروتوكول تسجيل خارج الخلية من العمل الاستجابات المحتملة التي أطلقتها الخلايا العصبية الذوق labellar في ذبابة الفاكهة.
Abstract
استجابة طعم الطرفية من الحشرات يمكن التحقيق بقوة مع تقنيات الكهربية. الطريقة الموضحة هنا يسمح الباحث لقياس الاستجابات الذوقية مباشرة وكميا، مما يعكس المدخلات الحسية أن الجهاز العصبي للحشرات تتلقاها من المحفزات طعم في بيئته. يحدد هذا البروتوكول جميع الخطوات الرئيسية في أداء هذه التقنية. الخطوات الحاسمة في تجميع وتلاعب الكهربية، مثل اختيار المعدات اللازمة وبيئة مناسبة للتسجيل، ويتم رسم. نحن تصف أيضا كيفية الاستعداد لتسجيل بجعل المرجعية وتسجيل الأقطاب المناسبة، والحلول منبهة للذوق. نحن تصف بالتفصيل الطريقة المستخدمة لإعداد الحشرات عن طريق ادراج الإلكترود المرجعي الزجاج في ذبابة من أجل شل خرطوم. نظهر آثار النبضات الكهربائية التي أطلقها الخلايا العصبية الذوق ردا على السكر ومجمع المر. جوانب البروتوكول هي رechnically صعبة ونحن وتشمل وصفا واسعة من بعض التحديات التقنية المشتركة التي يمكن مواجهتها، مثل عدم وجود إشارة أو الضوضاء المفرطة في النظام، والحلول المحتملة. تقنية له حدود، مثل عدم القدرة على تقديم المحفزات المعقدة زمنيا، ومراقبة خلفية إطلاق النار مباشرة قبل التحفيز التسليم، أو استخدام مركبات غير قابلة للذوبان في الماء طعم مريح. على الرغم من هذه القيود، هذه التقنية (بما في ذلك الاختلافات الطفيفة المشار إليها في البروتوكول) هو المعيار، والإجراءات المقبولة على نطاق واسع لتسجيل الاستجابات العصبية ذبابة الفاكهة لتذوق المركبات.
Introduction
حاسة التذوق يسمح حشرة للكشف عن مجموعة واسعة من المواد الكيميائية القابلة للذوبان، ويلعب دورا هاما في قبول مادة مغذية، أو رفض واحد الضارة أو السامة. ويعتقد الذوق أيضا للعب دور في اختيار الشريك، من خلال الكشف عن الفيرومونات 1-5. جعلت هذه الوظائف الهامة والمتنوعة النظام طعم الحشرات هدفا مقنعة للتحقيق في كيفية النظم الحسية ترجمة الاشارات البيئية في المخرجات السلوكية ذات الصلة.
الوحدة الأساسية للنظام طعم البطن ذبابة الفاكهة هو الشعر والذوق، أو sensillum و. جزيئات دخول sensillum وعبر المسام في 2،6 طرفها. تم العثور على الشعيرات labellum، والساقين، وهامش الجناح، والبلعوم 6. على labellum، والنمطية عدد وموقع الشعيرات. هناك ثلاث فئات من الشعيرات المورفولوجية بناء على طول: طويل (L) والمتوسطة (I)، وقصيرة (S ) الشعيرات 7،8. يحتوي كل sensillum وإما اثنين (I-نوع) أو أربعة (L-S-نوع و) الخلايا العصبية مستقبلات الذوقية (GRNs) 9. GRNs مختلفة الرد على فئات مختلفة من المحفزات طعم: المر والسكر والملح والأسمولية 7،10 والتعبير عن مجموعات فرعية مختلفة من المستقبلات الذوقية 8،11-13. فقط أنا وS-نوع الشعيرات تحتوي GRNs المر استجابة 8،10. يتم ترحيل المشروع GRNs إلى العقدة تحت المريء (مجموعة العمليات الخاصة) والتنشيط من خلال جزيئات الذوق إلى الجهاز العصبي المركزي العالي لفك التشفير، مما أدى إلى استجابة سلوكية 6. عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية وقابليته للتحليل الجزيئي والسلوكية جعل النظام طعم ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا للتحقيق في أنظمة الذوقية بشكل عام. السهولة النسبية التي يمكن التلاعب بها النظام عبر طفرة جينية أو نظام التعبير GAL4-UAS أيضا بمثابة أداة قيمة 14،15.
ontent "> لأن هذه الشعيرات تبرز من سطح labellum، لأنها تجعل أهداف ممتازة للالكهربية. اطلاق النار من GRNs يمكن رصدها باستخدام تسجيل خارج الخلية. تاريخيا، وطريقة تسجيل جنبا إلى الجدار، والذي يستخدم الزجاج الكهربائي إدراجها في sensillum وتسجيل نشاط الخلايا العصبية، وقد استخدم 26، ولكن هذا الأسلوب يمثل تحديا تقنيا على القيام بها، وأنه من الصعب أن يسجل لفترة طويلة من كل إعداد. طريقة غيض تسجيل، والذي يقيس استجابة الخلايا العصبية مع القطب أن في وقت واحد يسلم منبهة للذوق، وأصبح منذ الأسلوب المفضل 9،16. وقد استخدمت وللتحقيق في نظام طعم ذبابة الفاكهة السوداء البطن 8،10،17،18 فضلا عن عدد من أنواع الحشرات الأخرى 19-23. له تم سهلت كثيرا من خلال تطوير مكبر للصوت tastePROBE، التي تغلبت احدة من العوائق الرئيسية لطريقة التسجيل عن طريق بلاغ للتعويضفرق الجهد الكبير بين الإلكترود المرجعي وsensillum والحشرات، مما يتيح للإمكانات العمل GRN ليتم تسجيلها دون التضخيم المفرط أو التصفية 24. وثمة تطور مهم آخر استخدام tricholine سترات كما بالكهرباء يسجل 25. TCC يقمع الاستجابات من GRN الحساسة للالأسمولية ولا تحفيز GRN الحساسة الملح، مما يجعل الاستجابات التي تم إنشاؤها بواسطة tastants المر والسكر أسهل بكثير لتحليل 25.نحن هنا تصف كيف يتم تنفيذ تسجيل غيض من ذبابة الفاكهة labellar الشعيرات حاليا في المختبر كارلسون. وهذا البروتوكول شرح كيفية تأسيس منصة مناسبة الكهربية، وكيفية إعداد الطاير، وكيفية تنفيذ تسجيلات الذوق. كما نقدم بعض البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تسجيل ممثل من مجموعات فرعية من ذبابة الفاكهة الشعيرات، وكذلك بعض القضايا المشتركة والحلول المحتملة التي يمكن مواجهتها عند استخدام هذاالتقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الشعيرات Labellar تختلف في سهولة تسجيل بسبب الاختلافات في التشكل وتنظيم التشريحية. أحيانا لا يستجيب إلى أي sensillum وtastants، حتى واحد ما هو معروف للحصول على رد إيجابي. التردد الذي يحدث هذا يختلف تبعا لنوع sensillum و. L الشعيرات هي الأكثر استجابة باستمرار وسهلة نسبيا للوصول بسبب طو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل NRSA 1F31DC012985 منحة دكتوراه مسبقا (لRD) ومنح المعاهد الوطنية للصحة لJC
نود أن نشكر الدكتور ينيا فايس لتعليقات مفيدة على المخطوطة، والدكتور ريان جوزيف لشخصيات مساعدة تجميع، والدكتور فريدريك ماريون-الإستطلاع للحصول على المشورة التقنية مفيدة. نود أيضا أن نعترف تعليقات مفيدة من أربعة المعلقين.
Materials
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
| Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
Referências
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of “bitter” taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. a. n. Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. . The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
