We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons in staat stelt te controleren activiteit in individuele eenheden van tethered kakkerlakken. Hier presenteren we een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt om ook hersenactiviteit opnemen in vrij bewegende insecten.
Toenemende belangstelling voor de rol van de hersenactiviteit in insecten motorbesturing vereist dat we in staat zijn toezicht te houden op neurale activiteit, terwijl insecten voeren natuurlijk gedrag. We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons de activiteit opnemen van meerdere neuronen tegelijk terwijl een tethered kakkerlak gedraaid of veranderde loopsnelheid. Terwijl een grote stap vooruit, tethered voorbereidingen bieden toegang tot beperkte gedrag en vaak geen feedback processen die zich in vrij bewegende dieren. We presenteren nu een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt op te nemen van het centrale complex van vrij bewegende kakkerlakken als ze lopen in een arena en omgaan met barrières door te draaien, klimmen of tunneling. In combinatie met hoge snelheid video en cluster snijden, kunnen we nu betrekking hersenactiviteit om verschillende parameters van de beweging van vrij gedragen insecten.
Dit artikel beschrijft een succesvol systeem voor het opnemen van neuronen in het centrale complex (CC) van de kakkerlak, Blaberus discoidalis, als het insect loopt in een arena en deals met voorwerpen die ervoor zorgen dat het om te draaien, tunnel onder of klimmen over obstakels. De draden kunnen ook worden aangesloten op een stimulator activiteit te roepen in de omliggende neuropil met als gevolg gedragsveranderingen.
In de afgelopen tien jaar veel aandacht is gericht op de rol die de verschillende gebieden van de hersenen in het controleren van gedrag van insecten. Veel van deze focus is gericht op de middellijn hersenen neuropils die gezamenlijk worden aangeduid als het centrale complex (CC). Er is vooruitgang geboekt als gevolg van grote rassen van technieken gericht vragen over de rol van de CC in gedrag. Deze technieken variëren van neurogenetische manipulaties, voornamelijk in Drosophila, gekoppeld behavimondelinge analyse 1-3, om elektrofysiologische technieken die de neurale activiteit in de CC en poging om die activiteit betrekking hebben op gedragsmatig relevante parameters te monitoren.
Elektrofysiologische technieken omvatten intracellulaire opname van individuele geïdentificeerde neuronen 4-9 en extracellulaire, vaak met multi channel sondes 10,11. Deze twee technieken zijn gratis. Intracellulaire opname met scherpe elektroden of whole cell patch biedt zeer gedetailleerde gegevens over geïdentificeerde neuronen, maar is beperkt tot een of twee cellen tegelijk, vereist weinig of geen beweging, en kan worden gehandhaafd voor een relatief korte periode van tijd. Extracellulaire opnames kunnen eenvoudig worden ingesteld, hoeft terughoudendheid niet nodig, en kan worden gehandhaafd voor uren. Met multi channel tetrodes en cluster snijden, kan vrij grote populaties van neuronen tegelijkertijd 9,12 worden geanalyseerd. Terwijl de hele cel patch is met succes gebruikt in tethered insecten 13, vinden wij dat er ook behoefte aan technieken die ons toelaten om neurale activiteit op te nemen in de hersenen voor langere tijd in vrij gedragen insecten zoals zij omgaan met belemmeringen voor voorwaartse beweging.
De noodzaak om op te nemen als het insect beweegt en stuitert op en neer duwde ons naar extracellulaire technieken. We hebben goed succes opname had ingehouden preparaten handel verkrijgbare 16 kanalen silicium sondes 11, maar de geringe omvang van zelfs grote kakkerlakken betekent dat de probes lichaam worden gemonteerd af. Dat, in combinatie met de gevoeligheid van de sonde tanden, die ze ongeschikt voor een gratis wandel preparaat. In twee eerdere projecten, gebruikten we bundels van fijne draden die een Tetrode soortgelijke opname eigenschappen te bereiken, maar in een meer robuuste regeling. Deze Tetrode bundels liet ons op te nemen van tethered kakkerlakken eend betrekking CC eenheid activiteit op veranderingen in te lopen en de snelheid 14 gedrag als gevolg van antennal contact met een staaf 10 draaien.
Zo nuttig als deze tethered voorbereidingen zijn en zullen blijven, doen ze presenteren een aantal beperkingen. Ten eerste, het gedrag dat het insect kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak. Dat wil zeggen, we konden gemakkelijk veranderingen in loopsnelheid of draaien roepen, maar klimmen en tunneling acties waren niet mogelijk, in ieder geval met de typische tether regeling. Ten tweede, onze tethered voorbereidingen zijn "open loop". Dat is, zij niet toestaan normale voortbewegingsapparaten feedback aan het systeem. Dus, zoals de kakkerlak ingeschakeld onze tether, de visuele wereld was niet dienovereenkomstig gewijzigd. Het is mogelijk om gesloten lus tether systemen te bouwen om dit soort feedback te introduceren. Ze worden echter beperkt door de complexiteit van de programmering en hardware van de gesimuleerde visuele omgeving. Nevertheless, vonden we dat we op onze bestaande tethered opname methoden zou kunnen verbeteren door het opnemen van het dier als het vrij in een arena of track en kwam objecten als hij zou in zijn natuurlijke omgeving gelopen.
Hoewel draadloze systemen voor de registratie van hersenactiviteit 15 zou ideaal zijn, de huidige systemen hebben beperkingen in het aantal opname-kanalen, de tijd van data-acquisitie, het leven en het gewicht van de batterij. Daarom hebben we gekozen om te proberen onze tethered opnamesysteem voor gebruik aan te passen in vrij bewegende preparaten. Betere draadloze systemen beschikbaar komen, kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast aan dergelijke inrichtingen. Het systeem dat wordt beschreven in dit artikel is licht van gewicht, werkt erg goed en lijkt weinig schadelijk effect op het gedrag van de kakkerlak hebben. Met een goedkope high speed camera en cluster snijden software, kan de activiteit in individuele hersenen neuronen worden gerelateerd aan beweging. Hier beschrijven we de preparatie van de Tetrode draden en hun implantatie in de hersenen van het insect en opnametechnieken voor elektrische activiteit en beweging en hoe die gegevens kunnen elkaar worden gebracht voor verdere analyse.
Terwijl de vorige elektrofysiologische studies over de CC of andere regio's van het insect hersenen ons heeft verstrekt inzicht in de centrale controle van het gedrag, de meeste van hen werden uitgevoerd in zowel ingetogen bereidingen 9,11 of tethered degenen 10,14. Dientengevolge, het dier zintuiglijke ervaring en fysiologische toestand kan verschillen van die in een natuurlijke omgeving. Bovendien is de gedragstaken dat het dier kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak onder deze omstandighede…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Nick Kathman voor suggesties en helpen bij de voorbereiding van het manuscript. Deze techniek werd ontwikkeld in samenwerking met het werk ondersteund door de AFOSR onder subsidie FA9550-10-1-0054 en de National Science Foundation onder Grant No IOS-1120305 om RER.
Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
Lynx-8 | Neuralynx | Use for multi-unit recording | |
Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multi-unit recording | |
High speed camera | Basler | A602f | Use fir video recording for walking experiments |
High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
Matlab | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and off-line data analysis |