Summary

Extracellulaire Wire Tetrode Opname in Brain vrijlopende Insecten

Published: April 01, 2014
doi:

Summary

We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons in staat stelt te controleren activiteit in individuele eenheden van tethered kakkerlakken. Hier presenteren we een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt om ook hersenactiviteit opnemen in vrij bewegende insecten.

Abstract

Toenemende belangstelling voor de rol van de hersenactiviteit in insecten motorbesturing vereist dat we in staat zijn toezicht te houden op neurale activiteit, terwijl insecten voeren natuurlijk gedrag. We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons de activiteit opnemen van meerdere neuronen tegelijk terwijl een tethered kakkerlak gedraaid of veranderde loopsnelheid. Terwijl een grote stap vooruit, tethered voorbereidingen bieden toegang tot beperkte gedrag en vaak geen feedback processen die zich in vrij bewegende dieren. We presenteren nu een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt op te nemen van het centrale complex van vrij bewegende kakkerlakken als ze lopen in een arena en omgaan met barrières door te draaien, klimmen of tunneling. In combinatie met hoge snelheid video en cluster snijden, kunnen we nu betrekking hersenactiviteit om verschillende parameters van de beweging van vrij gedragen insecten.

Introduction

Dit artikel beschrijft een succesvol systeem voor het opnemen van neuronen in het centrale complex (CC) van de kakkerlak, Blaberus discoidalis, als het insect loopt in een arena en deals met voorwerpen die ervoor zorgen dat het om te draaien, tunnel onder of klimmen over obstakels. De draden kunnen ook worden aangesloten op een stimulator activiteit te roepen in de omliggende neuropil met als gevolg gedragsveranderingen.

In de afgelopen tien jaar veel aandacht is gericht op de rol die de verschillende gebieden van de hersenen in het controleren van gedrag van insecten. Veel van deze focus is gericht op de middellijn hersenen neuropils die gezamenlijk worden aangeduid als het centrale complex (CC). Er is vooruitgang geboekt als gevolg van grote rassen van technieken gericht vragen over de rol van de CC in gedrag. Deze technieken variëren van neurogenetische manipulaties, voornamelijk in Drosophila, gekoppeld behavimondelinge analyse 1-3, om elektrofysiologische technieken die de neurale activiteit in de CC en poging om die activiteit betrekking hebben op gedragsmatig relevante parameters te monitoren.

Elektrofysiologische technieken omvatten intracellulaire opname van individuele geïdentificeerde neuronen 4-9 en extracellulaire, vaak met multi channel sondes 10,11. Deze twee technieken zijn gratis. Intracellulaire opname met scherpe elektroden of whole cell patch biedt zeer gedetailleerde gegevens over geïdentificeerde neuronen, maar is beperkt tot een of twee cellen tegelijk, vereist weinig of geen beweging, en kan worden gehandhaafd voor een relatief korte periode van tijd. Extracellulaire opnames kunnen eenvoudig worden ingesteld, hoeft terughoudendheid niet nodig, en kan worden gehandhaafd voor uren. Met multi channel tetrodes en cluster snijden, kan vrij grote populaties van neuronen tegelijkertijd 9,12 worden geanalyseerd. Terwijl de hele cel patch is met succes gebruikt in tethered insecten 13, vinden wij dat er ook behoefte aan technieken die ons toelaten om neurale activiteit op te nemen in de hersenen voor langere tijd in vrij gedragen insecten zoals zij omgaan met belemmeringen voor voorwaartse beweging.

De noodzaak om op te nemen als het insect beweegt en stuitert op en neer duwde ons naar extracellulaire technieken. We hebben goed succes opname had ingehouden preparaten handel verkrijgbare 16 kanalen silicium sondes 11, maar de geringe omvang van zelfs grote kakkerlakken betekent dat de probes lichaam worden gemonteerd af. Dat, in combinatie met de gevoeligheid van de sonde tanden, die ze ongeschikt voor een gratis wandel preparaat. In twee eerdere projecten, gebruikten we bundels van fijne draden die een Tetrode soortgelijke opname eigenschappen te bereiken, maar in een meer robuuste regeling. Deze Tetrode bundels liet ons op te nemen van tethered kakkerlakken eend betrekking CC eenheid activiteit op veranderingen in te lopen en de snelheid 14 gedrag als gevolg van antennal contact met een staaf 10 draaien.

Zo nuttig als deze tethered voorbereidingen zijn en zullen blijven, doen ze presenteren een aantal beperkingen. Ten eerste, het gedrag dat het insect kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak. Dat wil zeggen, we konden gemakkelijk veranderingen in loopsnelheid of draaien roepen, maar klimmen en tunneling acties waren niet mogelijk, in ieder geval met de typische tether regeling. Ten tweede, onze tethered voorbereidingen zijn "open loop". Dat is, zij niet toestaan ​​normale voortbewegingsapparaten feedback aan het systeem. Dus, zoals de kakkerlak ingeschakeld onze tether, de visuele wereld was niet dienovereenkomstig gewijzigd. Het is mogelijk om gesloten lus tether systemen te bouwen om dit soort feedback te introduceren. Ze worden echter beperkt door de complexiteit van de programmering en hardware van de gesimuleerde visuele omgeving. Nevertheless, vonden we dat we op onze bestaande tethered opname methoden zou kunnen verbeteren door het opnemen van het dier als het vrij in een arena of track en kwam objecten als hij zou in zijn natuurlijke omgeving gelopen.

Hoewel draadloze systemen voor de registratie van hersenactiviteit 15 zou ideaal zijn, de huidige systemen hebben beperkingen in het aantal opname-kanalen, de tijd van data-acquisitie, het leven en het gewicht van de batterij. Daarom hebben we gekozen om te proberen onze tethered opnamesysteem voor gebruik aan te passen in vrij bewegende preparaten. Betere draadloze systemen beschikbaar komen, kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast aan dergelijke inrichtingen. Het systeem dat wordt beschreven in dit artikel is licht van gewicht, werkt erg goed en lijkt weinig schadelijk effect op het gedrag van de kakkerlak hebben. Met een goedkope high speed camera en cluster snijden software, kan de activiteit in individuele hersenen neuronen worden gerelateerd aan beweging. Hier beschrijven we de preparatie van de Tetrode draden en hun implantatie in de hersenen van het insect en opnametechnieken voor elektrische activiteit en beweging en hoe die gegevens kunnen elkaar worden gebracht voor verdere analyse.

Protocol

1. Voorbereiding van Tetrode Draden Trek een zeer dunne nichrome draad (12 micrometer diameter, PAC coating) van ongeveer 1,1 m lengte. Bevestig een tape tag aan elk uiteinde. Hang de draad over een horizontale draadstang zodanig dat de beide uiteinden op dezelfde hoogte bij de stationaire. Herhaal stap 1.1 voor een tweede draad, waardoor twee uiteinden voor een totaal van 4, en leg deze naast de eerste draad (ongeveer 1 cm ertussen). Plak de vier uiteinden samen met een tape-tag en bevest…

Representative Results

We namen de neurale activiteit van 50 eenheden van de CC in 27 voorbereidingen voor wandelen experimenten. Voor 15 van deze preparaten (23 eenheden), werden klimmen experimenten ook uitgevoerd. Individuele eenheden worden benoemd op basis van voorbereiding en eenheid nummers (bijv. unit 1-2 geeft voorbereiding 1, unit 2). Momentopnamen van de video van een klimmen proef zijn weergegeven in Figuur 4. Het hele video is in aanvullende Video 1 (Het gelu…

Discussion

Terwijl de vorige elektrofysiologische studies over de CC of andere regio's van het insect hersenen ons heeft verstrekt inzicht in de centrale controle van het gedrag, de meeste van hen werden uitgevoerd in zowel ingetogen bereidingen 9,11 of tethered degenen 10,14. Dientengevolge, het dier zintuiglijke ervaring en fysiologische toestand kan verschillen van die in een natuurlijke omgeving. Bovendien is de gedragstaken dat het dier kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak onder deze omstandighede…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken Nick Kathman voor suggesties en helpen bij de voorbereiding van het manuscript. Deze techniek werd ontwikkeld in samenwerking met het werk ondersteund door de AFOSR onder subsidie ​​FA9550-10-1-0054 en de National Science Foundation onder Grant No IOS-1120305 om RER.

Materials

Nichrome wire  Sandvik Heating Technology Kanthal RO-800 Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing A-M Systems 800700 Use for tetrode tubing
Lynx-8 Neuralynx Use for multi-unit recording
Cheetah 32 Neuralynx Use for multi-unit recording
High speed camera Basler A602f Use fir video recording for walking experiments
High speed camera Casio EX-FC150  Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze Winanalyze version 1.4 3D Use for video tracking 
Matlab MathWorks MATLAB R2012b Use for TTL pulse generation and off-line data analysis

Referências

  1. Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
  2. Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
  3. Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila. Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).
  4. Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. Transformation of polarized light information in the central complex of the locust. J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).
  5. Heinze, S., Homberg, U. Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect. Science. 315, 995-997 (2007).
  6. Heinze, S., Homberg, U. Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons. J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).
  7. Heinze, S., Homberg, U. Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex. J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).
  8. Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
  9. Brill, M. F., et al. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).
  10. Guo, P., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors. J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).
  11. Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis. J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).
  12. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).
  13. Huston, S. J., Jayaraman, V. Studying sensorimotor integration in insects. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).
  14. Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).
  15. Harrison, R. R., et al. Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE. 5, 103-111 (2011).
  16. Straw, A. D., Dickinson, M. H. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol. Med. 4, 5 (2009).
  17. Tyrer, N. M., Shaw, M. K., Altman, J. S., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. . Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System. , (1980).
  18. Daly, K., Wright, G., Smith, B. Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta. J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).
  19. Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).

Play Video

Citar este artigo
Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects. J. Vis. Exp. (86), e51337, doi:10.3791/51337 (2014).

View Video