セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

1。 DNAテンプレートの準備 E.標準の実験室株からのプラスミド浄化例えば大腸菌などの大腸菌 、市販のキットで大腸菌 DH5αをまたはノヴァブルー。あるいは、線形PCR産物を、同様に市販のキットを用いて精製することができる。唯一のH 2 OでDNAを溶出。 フェノール-クロロホルムはDNA溶液26を抽出します。 UV吸光度または他の適当な方法によって、 例えば DNA濃度と純度を決定します。転写翻訳効率的な高純度のDNAを用いることが重要である。 2。薄い脂質フィルムを準備する乾燥脂質粉末を秤量し、溶媒中に溶解する。 1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（POPC）については、ストック溶液は、40 mg / mlの濃度のクロロホルム中で調製される。 注：有機溶剤は常にガラスピペットとボトルで処理しなければなりません。言い換えれば、プラスチックを使用してはいけません。店舗s好ましくは、アルゴン下、-20℃で気密、耐溶剤アンバーガラスボトルタックソリューション。 アリコート12マイクロモルPOPC（40 mg / mlのストック溶液220μL）5 mlの丸底フラスコに。 薄い脂質フィルムを生成するためのロータリーエバポレーター（ 図1）で溶媒を蒸発させる。 しっかりと円形のクリップで蒸留管に丸底フラスコを取り付け、フラスコの回転を開始。 凝縮器コイルを通じて水の循環を開始します。クロロホルム61.2の低沸点℃で常圧でCを持っているので、熱浴を使用して、必要ではない。 システムはコックが開いていることを確認することにより、大気に開放されていることを確認してください。真空ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシステムに真空を適用するためのコックを閉じてください。 薄い脂質膜は遮光膜を形成し、回転蒸発中の丸底フラスコの壁面上に堆積されるそれは、目で見えるようになります。ロータリーエバポレーターは0.5-2時間続けてみましょう。プロセスを停止するには、徐々に、真空圧力を解放回転を停止し、丸底フラスコを除去する。 3。脂質再懸濁およびベシクル均質直接丸底フラスコ内の薄い脂質膜に1ミリリットル18.2MΩH 2 Oを加える。最大速度で激しく渦ソリューション、約3,200 rpmで、脂質膜が目で観察されたガラスから切り離しまで。 2 mlのマイクロチューブに脂質分散を転送します。 セットアップリングは、5mmチップでホモジナイザーを保持するために立っている。しっかりと脂質分散を保持するためにホモジナイザー下マイクロスタンドを置きます。 18.2MΩH 2 Oで先端を浸漬し、数秒間実行することにより、ホモジナイザーの分散要素をすすぐ。 番目を確保脂質分散に直接分散要素を配置先端にマイクロ遠心チューブの底に触れない。電力レベル4または14,000 rpmで1分間ホモジナイズする。 4。小胞の放出と凍結乾燥アウターケーシングや家2テフロン内部の膜がサポートするリテーナナット、2つのOリング、および1テフロン軸受けで構成されたミニ押出機（ 図2）の部品を組み立てる。 内部膜支持体の溝に2個の​​O-リングを置きます。予め湿らせつのフィルタと1 400 nmの膜。フィルタは、それらの間の膜とO-リングの内側にテフロン（登録商標）に対して配置される。 膜がOリングの間に2つのフィルタに囲ま膜と押出アウターケーシングにサポートしています置きます。ケーシング内にテフロンベアリングを配置し、リテーナナットを取り付け、手で締めます。 2シリンジをすすぎ、18.2MΩ水を持つものを記入してください。小さな時間に注射針を挿入します押出機アセンブリの両端にテフロンでoles。針は簡単にスライドするはず;針を無理に押し込まないでください。押出機ハウジングと締めに注射器で押出機を固定します。 ゆっくりと1注射器のうち、その他の中に水を押すことにより押出機を通して水を渡します。これは、1つの通路を表している。現在の漏れがないことを確実に3通路の合計に対して、この手順を繰り返します。水の注射器を取り出し、水を処分する。 サンプルと1シリンジを埋める、押出機に取り付け、ステップ4.3で上記のように徐々に膜を通って小胞ソリューションを渡す。 11通路の合計10倍を繰り返します。押出プロセスが進むにつれて、試料は、膜を横切ってプッシュするために以下の混濁かつ容易になるであろう。抵抗の急激な減少が、しかしながら、通常、膜の破裂を示している。 押し出された小胞のソリューションを転送し、マイクロチューブに小胞の40μlのアリコートを行います。Flashには、どちらのドライアイスや液体窒素の各アリコートを凍結。 30で一晩遠心エバポレーター℃まで、各アリコートを凍結乾燥-20℃で凍結乾燥した空胞を保存 5。転写 – 翻訳機械をカプセル化転写·翻訳反応の成分を混合し、RNase阻害の20ユニットを追加。氷の上でインキュベートする。 DNAテンプレートを追加します。コントロール反応のために、250をコードするプラスミドのmVenusのNGまたはT7転写プロモーターの後ろに類似の蛍光タンパク質と強いE.大腸菌リボソーム結合部位をお勧めします。 RNaseフリー水で最終体積を25μlをもたらす。 ステップ5.3で組み立て反応液10μlと凍結乾燥胞の水和物アリコート（ステップ4.6から）。簡潔にボルテックス混合ベシクルを再懸濁されるまで。これは、以下の30秒を取るべきである。 3のために氷の上での反応をインキュベート胞を膨潤できるように0分。 50mMのトリス-HCl、50mMのNaCl、pH7.4のの27.0μL及び20.2 mg / mlのプロテ​​イナーゼKのDNaseとRNaseを1.5μlのに小胞の1.5μLを加えることにより、30μlの最終容量に20倍胞混合物を希釈また胞外物質を分解するプロテイナーゼKの代替として、この時点で添加することができる。 37少なくとも2.5時間インキュベート℃、 6。顕微鏡検査小胞と異なる時点で蛍光タンパク質生産の進捗状況を調べる。小胞は400nmの小胞の放出のために使用される膜の孔径よりも大きな直径を有する。 標準的な顕微鏡スライド上に20×5ミリメートルシリコンスペーサを配置することによって、試料室を準備します。試料室への小胞のピペットを10μl。室以上シリコン処理ガラスカバースリップを置きます。 63X油分散Oで小胞を観察する搾取蛍光タンパク質の適切なフィルターセットを用いて明視野と蛍光顕微鏡法によるRと同様の目的。