L'encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

1. Préparation de la matrice d'ADN Purifier plasmide à partir d'une souche de laboratoire standard de E. coli, tels que E. coli DH5a ou en Nouvelle-bleu avec un kit commercial. Alternativement, un produit PCR linéaire peut être purifié même avec un kit commercial. On élue l'ADN avec H 2 O seulement. Phénol-chloroforme extraire la solution d'ADN 26. Déterminer la concentration de l'ADN et de la pureté, par exemple par absorbance UV ou d'autres méthodes appropriées. Il est important d'utiliser l'ADN de haute pureté pour l'efficacité de transcription-traduction. 2. Préparation de la Lipid Thin Film Peser la poudre lipidique sec et dissoudre dans un solvant. Pour 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), les solutions mères sont préparées dans du chloroforme à une concentration de 40 mg / ml. Note: solvants organiques doivent être manipulés avec des pipettes en verre et de bouteilles. En d'autres termes, le plastique ne doit jamais être utilisé. S Storesolutions tock dans serrés, solvants bouteilles en verre de couleur ambre résistant à l'air à -20 ° C, de préférence sous argon. Aliquote 12 pmol POPC (220 ul de 40 mg / ml de solution mère) dans un ballon à fond rond de 5 ml. On évapore le solvant à l'évaporateur rotatif (figure 1) pour générer le film lipidique mince. Fixer fermement le ballon à fond rond pour le tube de distillation avec une pince circulaire et démarrer la rotation du ballon. Initier la circulation de l'eau à travers le serpentin de condenseur. L'utilisation d'un bain de chaleur n'est pas nécessaire, parce que le chloroforme a un faible point d'ébullition de 61,2 ° C à la pression atmosphérique normale. Assurez-vous que le système est ouvert à l'atmosphère par vérifier que le robinet est ouvert. Tournez sur la pompe à vide et fermer lentement le robinet d'appliquer le vide pour le système. Un film mince de lipides se dépose sur les parois du ballon à fond rond pendant l'évaporation rotative formant un film opaquece qui est visible à l'œil nu. Soit l'évaporation rotative continuer à 0,5-2 h. Pour arrêter le processus, relâchez lentement la pression de vide, arrêter la rotation, et enlever le ballon à fond rond. 3. La remise en suspension des lipides et l'homogénéisation des vésicules Ajouter 1 ml 18,2 MQ H 2 O pour le film lipidique mince directement dans le ballon à fond rond. Vigoureusement vortex de la solution à la vitesse maximale, soit environ 3200 tours par minute, jusqu'à ce que le film lipidique se détache du verre, qui est observable à l'oeil nu. Transférer la dispersion lipidique dans un tube de 2 ml. Mise en place d'un anneau support pour tenir une homogénéisation avec une pointe de 5 mm. Placer une cale de centrifugation ci-dessous l'homogénéisateur pour tenir solidement la dispersion des lipides. Rincez l'élément de dispersion de l'homogénéisation en plongeant la pointe dans 18,2 MQ H 2 O et courir pendant quelques secondes. Placer l'élément de dispersion directement dans la dispersion lipidique assurant èmeà la pointe ne touche pas le fond du tube de centrifugation. Homogénéiser pendant 1 min à puissance 4 ou 14.000 tours par minute. 4. Extrusion des vésicules et lyophilisation Assembler les parties de la mini-extrudeuse (figure 2), qui se compose d'une enveloppe extérieure et d'un écrou de retenue qui loge deux membrane Téflon interne prend en charge, les deux joints toriques, et un palier en téflon. Placer les deux joints toriques dans les rainures des supports de membrane interne. Pré-imbibé deux filtres et une membrane de 400 nm. Les filtres seront placés contre le Teflon à l'intérieur des joints toriques avec la membrane entre eux. Placer la membrane prend en charge dans la gaine à l'extrudeuse avec la membrane entourée de deux filtres en entre les joints toriques. Placer le roulement Teflon l'intérieur du boîtier et fixez l'écrou de retenue et serrer à la main. Rincer deux seringues et de remplir un avec 18,2 MQ eau. Insérer les aiguilles de seringues dans le petit holes du téflon sur chaque extrémité de l'ensemble d'extrusion. Les aiguilles doivent glisser facilement, ne forcez pas les aiguilles. Fixez l'extrudeuse avec les seringues dans le boîtier extrudeuse et coudre. Faire passer l'eau à travers l'extrudeuse en poussant doucement l'eau sur une seringue et dans l'autre. Cela représente un passage. Répétez l'opération pour un total de trois passages assurant qu'il n'y a pas de fuites actuelles. Retirez la seringue de l'eau et de disposer de l'eau. Remplir une seringue avec l'échantillon, attacher à l'extrudeuse, et passer lentement la solution de vésicules à travers la membrane tel que décrit ci-dessus à l'étape 4.3. Répétez 10 fois pour un total de 11 passages. Comme le procédé d'extrusion produit, l'échantillon sera moins trouble et plus facile à pousser à travers la membrane. Une baisse soudaine de la résistance, cependant, indique généralement une rupture de la membrane. Transférer la solution de la vésicule extrudé et faire 40 aliquotes des vésicules dans des microtubes.Un gel chaque aliquote soit dans de la neige carbonique ou l'azote liquide. Lyophiliser chaque aliquote avec un évaporateur centrifuge pendant la nuit à 30 ° C. Stocker les vésicules vides lyophilisés à -20 ° C. 5. Encapsulation transcription-traduction Machinery Mélanger les composants de la réaction de transcription-traduction et ajouter 20 unités d'inhibiteur de RNase. Incuber sur de la glace. Ajouter la matrice d'ADN. Pour obtenir une réaction de contrôle, 250 ng de plasmide mVenus de codage ou une protéine fluorescente similaire derrière un promoteur de transcription T7 et une forte E. coli site de liaison de ribosome est recommandé. Porter le volume final de 25 pi avec de l'eau sans RNase. Hydratez une aliquote de vésicules lyophilisés (de l'étape 4.6) avec 10 pl de la réaction assemblé à l'étape 5.3. vortex brièvement le mélange jusqu'à ce que les vésicules sont remises en suspension. Cela devrait prendre moins de 30 secondes. Incuber la réaction sur la glace pendant 30 min pour permettre aux vésicules à gonfler. Diluer le mélange de la vésicule 20 fois pour un volume final de 30 pi en ajoutant 1,5 ul de vésicules dans 27,0 ul de 50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, pH 7,4 et 1,5 ul de 20,2 mg / ml protéinase K. DNase et RNase peuvent également être ajoutés à ce stade comme une alternative à la protéinase K à dégrader matière extravésiculaire. Incuber pendant au moins 2,5 h à 37 ° C. 6. Microscopie Examiner les vésicules et les progrès de la production de la protéine fluorescente à différents points dans le temps. Les vésicules auront un diamètre plus grand que les pores de 400 nm de taille de la membrane utilisée pour l'extrusion de la vésicule. Préparer une chambre d'échantillon en plaçant un x 5 mm entretoise 20 de silicium sur une lame de microscope standard. Pipette 10 pl de vésicules dans la chambre de l'échantillon. Placez une siliconé lamelle de verre sur la chambre. Respecter les vésicules avec un 63X huile dispersion or objectif similaire par champ lumineux et la microscopie de fluorescence en utilisant l'ensemble de filtre correspondant pour la protéine fluorescente exploité.