Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva hur man ska spela live avbildning av neurala progenitorceller mitos i embryonala hjärnan skivor. Med hjälp av live-avbildning av hjärnan skivor i kultur, ger detta protokoll en enkel metod för att analysera olika aspekter av mitos i neurala stamceller i en miljö som i hög grad liknar en in vivo-miljö. Den kan tillämpas på hjärnan hos muterade djur och / eller hjärnor som har manipulerats med i livmodern elektroporering) ^1-5. Denna teknik är också idealiskt för att testa effekten av farmakologiska medel på neurala prekursorer "mitos genom att helt enkelt tillsätta ett medel till odlingsmediet. Sammanfattningsvis kommer den här artikeln att göra ett tekniskt utmanande protokoll tillgänglig för dem som studerar neurogenes.

Under neurogenes, distinkta neurala stamceller populationer genomgår noggranna divisioner att generera nervceller som så småningom bidrar till de sex kortikala skikt av den vuxna neocortex ^6-8. Tidigt i kortikal utveckling, det neurala föregångare poolen expanderar som neuroepiteliala (NE) celler delar symmetriskt att själv förnya. NE celler omvandlar därefter in i radiella gliaceller (RGC). Inledningsvis RGC dela symmetriskt att producera två nya RGC, men under större delen av neurogenes, är asymmetrisk RGC främsta läge för division. I asymmetrisk uppdelning ger en RGC upphov till en ny RGC och antingen en post-mitotiska neuron, eller en mer specialiserad progenitor (antingen en kort neural prekursor (SNP), en yttre radiell glia (ORG), eller en mellanprodukt progenitor (INP) ^2,3,7,9. INPS SNPs och Orgs kan sedan generera nervceller på sub-ventrikulära, ventrikulär och basala regionerna av cortex, respektive. Därför är celldelning av progenitorer en grundläggande process för att generera nervceller i neocortex.

Ett flertal studier pekar på ett samband mellan specifika mitotiska drag av RGC: er och ödet av dotterceller. Haydar et al. Och Takahashi et al.har visat att RGC mitotiska varaktighet och cellcykel ökad längd som neurogenesis fortskrider, ekade en slutsats i uppföljningsstudier ^10-13. Ett antal studier har visat att mitotiska spindeln orientering i förhållande till kammaren påverkar aspekter av neurogenes och corticogenesis, däribland typer av nervceller genereras och placering av avkomma i hjärnan, respektive ^3,10,14-16. Oavsett om klyvning plan orientering påverkar direkt cell öde är kontroversiell, men slutsatsen kvarstår att detta mitotiska parameter effekter neurogenes. Vidare understryker vikten av mitos är iakttagelsen att många gener som är involverade i mekaniken i mitos är avgörande för neurogenes och för korrekt hjärnans utveckling ^17-20.

Mitos är en dynamisk process, men hittills mest studier som beskriver neurala progenitorceller mitos utnyttja analys av sektioner eller avbildning av neurala stamceller fast vävnad via cellodling in vitro. Således, de traditionella metoder för att utvärdera mitos bara ge en ögonblicksbild av denna process och misslyckas med att avslöja hur celler beter sig i en vävnad. Live avbildning av neurala progenitorceller mitos har allt mer blivit ett viktigt verktyg för att förstå neural progenitor funktion. För exempel hänvisas till dessa referenser ^{4,8,10,21-25.} Flera framstående protokoll har publicerats för förberedelse och avbildning av hjärnan skivor ^26,27. Men till dags dato har ett omfattande protokoll för avbildning och analys av mitosen inte beskrivits eller visats i videon.

Denna teknik ger flera viktiga fördelar jämfört med fasta analys av hjärnsektioner. Time-lapse analys av hjärnan skivor möjliggör generering av betydligt fler datapunkter som kan analyseras på ett flexibelt sätt. För det första är data som samlats in vid enskilda tidpunkter under loppet av flera minuter eller flera timmar. Man kan analysera enskilda tidpunkter (för att skapa en statisk montage) ellerkan kombinera olika tidpunkter i filmer. För det andra, konfokal avbildning av skivor gör det möjligt att ta fram uppgifter på olika Z-sektioner i hjärnan skivor. Som ett resultat kan de enskilda sektionerna skall analyseras. Alternativt kan högar av enskilda avsnitt kombineras till en maximal intensitet projektion. För det tredje, är analys görs i samband med en vävnad, avslöjar hur celler delar i förhållande till angränsande celler och strukturer. För det fjärde är den idealisk för analys av mutanter som visar vissa tecken på mitotiska defekter. Tillsammans detta protokoll kommer att bidra till att klargöra viktiga steg för att hjälpa utredarna som vill utföra live-avbildning av neurala progenitorceller mitos i sina egna laboratorier.