Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos
Summary
Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.
Abstract
Apesar de curta duração, a mitose é um processo multi-passo complexo e dinâmico fundamental para o desenvolvimento de órgãos, incluindo o cérebro. No córtex cerebral em desenvolvimento, a mitose anormal das células progenitoras neurais pode causar defeitos de tamanho e função do cérebro. Portanto, há uma necessidade crítica de ferramentas para compreender os mecanismos da mitose neural progenitor. Desenvolvimento cortical em roedores é um modelo excelente para estudar este processo. Neural mitose progenitor é comumente examinadas em seções cerebrais fixos. Este protocolo irá descrever em detalhe uma abordagem para geração de imagens ao vivo de mitose em ex vivo fatias cerebrais embrionárias. Vamos descrever os passos críticos para este procedimento, que incluem: extração do cérebro, a incorporação do cérebro, vibratome seccionamento de fatias do cérebro, coloração e cultura de fatias e imagem time-lapse. Nós, então, demonstrar e descrever em detalhes como realizar a análise pós-aquisição da mitose. Nós incluímos os resultados representativos from este ensaio utilizando o corante vital Syto11, ratinhos transgénicos (histona H2B-EGFP e Centrin-EGFP), no útero e electroporação (mCherry α-tubulina). Vamos discutir como este processo pode ser melhor otimizado e como ele pode ser modificado para o estudo da regulação genética da mitose. Imagens ao vivo da mitose em fatias de cérebro é uma abordagem flexível para avaliar o impacto da idade, anatomia e perturbação genética em um ambiente controlado, e para gerar uma grande quantidade de dados com alta resolução temporal e espacial. Assim, este protocolo irá complementar as ferramentas existentes para análise de neural mitose progenitor.
Introduction
O objetivo geral deste protocolo é para descrever como realizar imagens ao vivo de neural mitose progenitor em fatias cerebrais embrionárias. Usando imagens ao vivo de fatias cerebrais em cultura, este protocolo fornece um método simples para analisar vários aspectos da mitose em progenitores neurais em um ambiente muito semelhante a um cenário in vivo. Ele pode ser aplicado aos cérebros de animais e / ou mutantes cérebros que foram manipuladas com eletroporação in utero) 1-5. Esta técnica também é ideal para testar o efeito de agentes farmacológicos na mitose "precursores neurais, por simples adição de um agente para o meio de cultura. Em suma, este artigo fará um protocolo tecnicamente desafiador acessível para aqueles que estudam a neurogênese.
Durante a neurogênese, as populações progenitoras neurais distintas sofrer divisões precisas para gerar neurônios que eventualmente contribuem para as seis camadas corticais do neocórtex adulto 6-8. No início do desenvolvimento cortical, a piscina precursor neural expande como células gliais (NE) divide simetricamente de auto-renovação. Células NE em seguida, converter em células gliais radiais (RGCs). Inicialmente CGR dividir simetricamente para produzir dois novos CGR, no entanto, durante a maior parte da neurogênese, o modo principal 'CGR da divisão é assimétrica. Na divisão assimétrica, um RGC dá origem a um novo e RGC ou um neurónio pós-mitótico, ou um progenitor mais especializado (ou um precursor neural curto (SNP), um glia radial exterior (ORG), ou um intermediário de progenitor (INP) 2,3,7,9. INP, SNPs e orgs pode então gerar neurónios no sub-ventricular, ventricular, e as regiões do córtex basal, respectivamente. Assim, a divisão celular das células progenitoras é um processo fundamental para a geração de neurónios do neocórtex.
Vários estudos apontam para uma correlação entre as características específicas do CGR mitose e o destino das células-filhas. Haydar et al. E Takahashi et al.têm demonstrado que a duração mitótico RGC e aumento do comprimento do ciclo celular como neurogênese receitas, uma descoberta ecoou em acompanhar os estudos 10-13. Um número de estudos têm sugerido que a orientação relativa do fuso mitótico para o ventrículo influencia aspectos da neurogénese e corticogenesis, incluindo os tipos de neurónios gerados e localização de progenitura no cérebro, respectivamente 3,10,14-16. Quer orientação plano de clivagem influencia diretamente o destino da célula é controversa, mas a conclusão é que este mitótico impactos parâmetros neurogênese. Além disso ressaltando a importância da mitose é a observação de que muitos genes envolvidos nos mecanismos da mitose são cruciais para a neurogênese e para o desenvolvimento adequado do cérebro 17-20.
A mitose é um processo dinâmico, no entanto, até o momento a maioria dos estudos que detalham neural mitose progenitor utilizar análise de cortes de tecidos fixos ou de imagem de progenitores neurais através de cultura in vitro de células. Assim, os métodos tradicionais para avaliar a mitose só fornecer um instantâneo desse processo e não conseguem descobrir como as células se comportam em um tecido. Imagens ao vivo de neural mitose progenitor tem se tornado uma ferramenta fundamental para a compreensão da função neural progenitor. Para exemplos veja estas referências 4,8,10,21-25. Vários protocolos pendentes foram publicadas para a preparação e tratamento de imagens de fatias do cérebro 26,27. No entanto até à data, um protocolo detalhado para a imagem e análise de mitose não tem sido descrito, nem demonstrado em vídeo.
Esta técnica oferece várias vantagens significativas sobre análise fixo de seções cerebrais. Análise Time-lapse de fatias do cérebro permite a geração de um número significativamente maior de pontos de dados que podem ser analisados de uma forma flexível. Em primeiro lugar, os dados são recolhidos em pontos de tempo individuais ao longo de vários minutos ou de várias horas. Pode-se analisar pontos de tempo individuais (para criar uma montagem estática) oupode combinar diferentes momentos em filmes. Em segundo lugar, confocal de imagens de fatias permite a geração de dados em diferentes seções Z em fatias de cérebro. Como resultado, as secções individuais pode ser analisado. Em alternativa, as pilhas de secções individuais podem ser combinadas em uma projecção de intensidade máxima. Em terceiro lugar, a análise é feita no contexto de um tecido, revelando como as células se dividem em relação às células e as estruturas vizinhas. Em quarto lugar, é idealmente adequado para a análise de mutantes que mostram alguma evidência de defeitos mitóticas. Juntos, este protocolo vai ajudar a esclarecer as etapas críticas para ajudar os investigadores que pretendam realizar imagens ao vivo de neural mitose progenitor em seus próprios laboratórios.
Protocol
Representative Results
Discussion
A principal vantagem do protocolo já descrito é que proporciona uma resolução temporal dinâmico de mitose de células progenitoras neurais. Normalmente, os ensaios para visualizar mitose no cérebro em desenvolvimento são realizadas através de imunofluorescência de cortes de tecidos fixos. Mas esta abordagem apenas fornece um instantâneo da mitose em um ponto do tempo.
Existem vários passos que são mais críticos para imagiologia de mitose em fatias de cérebro de: 1) As fatias de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o financiamento do NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
Referências
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