Denne videoen illustrerer en metode, ved hjelp av en klinisk 3 T scanner, for kontrastforsterket MR avbildning av den naive mus visuell projeksjon og for repeterende og langsgående in vivo studier av synsnerven degenerasjon assosiert med akutt synsnerven klemskade og kronisk synsnerven degenerasjon i knock-out mus (p50 KO).
Den gnager visuelle systemet omfatter retinal ganglion celler og deres axons som danner synsnerven til å gå inn thalamic og midthjernen sentre, og postsynaptiske anslag til den visuelle cortex. Basert på sin distinkte anatomisk struktur og praktisk tilgjengelighet, har det blitt den favoriserte struktur for studier på nevronale overlevelse, aksonal regenerasjon, og synaptisk plastisitet. Nye fremskritt i MR har aktivert in vivo visualisering av retino-tectal del av dette anslaget ved hjelp av mangan mediert kontrastforbedring (MEMRI). Her presenterer vi en MEMRI protokoll for illustrasjon av videogrammer i mus, der oppløsning på (200 mikrometer) 3 kan oppnås ved hjelp av vanlige 3 Tesla skannere. Vi viser hvordan intravitreal injeksjon av en eneste dose på 15 nmol MnCl 2 fører til et mettet forbedring av intakt projeksjon i 24 timer. Med unntak av netthinnen, er endringer i signalintensitet uavdent av sammenfalt visuell stimulering eller fysiologiske aldring. Vi søker videre denne teknikken til lengde overvåke aksonal degenerasjon i respons til akutt synsnerven skade, et paradigme der Mn 2 + transport helt arrestasjoner på lesjonen nettstedet. Motsatt er aktiv Mn 2 + transport kvantitativt i forhold til levedyktighet, antall, og elektriske aktiviteten i axon fibre. For en slik analyse, eksemplifiserer vi Mn 2 + transportkinetikk langs den visuelle banen i en transgen musemodell (NF-κB p50 KO) viser spontan atrofi av sensoriske, inkludert visuelle, projeksjoner. I disse musene, indikerer MEMRI redusert, men ikke forsinket Mn 2 + transport i forhold til villtype mus, og dermed avsløre tegn på strukturelle og / eller funksjonsnedsettelser av NF-κB mutasjoner.
I sammendraget, MEMRI beleilig broer in vivo og post mortem histologi for characterizatipå av nerve fiber integritet og aktivitet. Det er svært nyttig for longitudinelle studier på aksonal degenerasjon og regenerasjon, og undersøkelser av muterte musene for ekte eller induserbare fenotyper.
Basert på sin gunstige nevro-anatomiske strukturen gnager visuelle systemet tilbyr unike muligheter for å evaluere farmakologiske forbindelser og deres evne til å megle neurobeskyttelse pt eller pro-regenerative effekter 2,3. Videre tillater det studier på de funksjonelle og nevro-anatomiske karakteristikker av mus mutanter, som nylig eksemplifisert for mus mangler den presynaptiske stillas protein Fagott fire. Videre gir et bredt spekter av tilleggsverktøy ekstra med av retinal ganglion celle (RGC) og RGC axon tall samt RGC aktivitet, for eksempel ved elektroretinografi og atferdstester, og fastsettelse av kortikale rearrangementer av optisk avbildning av iboende signaler. De nyeste tekniske utviklingen innen lasermikros aktivere in situ visualisering av RGC regenerering av dype vev fluorescens bildebehandling i hele fjellet eksemplarer av synsnerven (ON) og hjerne. I denne histological tilnærming, tetrahydrofuran basert vev clearing i kombinasjon med lys ark fluorescens mikroskopi tillater oppløsning på enkeltfibre som re-gå inn i deafferented ON og optikk kanalen fem. Selv om slike teknikker kan være overlegen i oppløsning og bestemmelse av vekstmønster, har de ikke gjør det mulig gjentatte og langsgående analyser av individuelle vekst arrangement, som er spesielt ønskelig for å vurdere prosessen med langvarig regenerering.
Kontrastforsterket MR har vært ansatt for minimal invasiv visualisering av retino-tectal projeksjon i mus og rotter 6,7. Dette kan oppnås ved direkte intraokulært levering av paramagnetiske ioner (f.eks, Mn 2 +) til netthinnens celler. Som kalsium analog, Mn 2 + er innlemmet i RGC somata via spenningsstyrte kalsiumkanaler og transporteres aktivt langs aksonal cytoskjelettet av intakt PÅ og optisk kanalen. Mens det hoper seg opp i hjernen kjernerav den visuelle fremvisning, dvs. den laterale geniculate kjernen (LGN) og superior colliculus (SC), transsynaptic forplantning inn i den primære visuelle cortex synes ubetydelig 8,9, selv om det kan forekomme 10,11. Under MR-sekvensering, paramagnetisk Mn 2 + forsterker MR kontrast hovedsakelig ved å forkorte T pt spin-gitter relaksasjonstiden 12. Slike Mn 2 + forbedret MR (MEMRI) har blitt brukt i ulike nevro-anatomiske og funksjonelle studier av rotter, inkludert vurderingen av aksonal regenerasjon og degenerasjon etter PÅ skade 13,14, presis anatomisk kartlegging av retino-tectal projeksjon 15 , så vel som bestemmelse av aksonal transport-egenskaper etter at den farmakologiske behandlingen 16.. Nylige forbedringer i dosering, giftighet, og kinetikk av nevronale Mn 2 + opptak og transport, samt forbedret MR protokoller har utvidet sin søknad til studier på transgenemus 9 bruker 3 Tesla skannere som vanligvis brukes i klinisk praksis 17.
Her presenterer vi en MEMRI protokoll egnet for langsgående in vivo avbildning av musen retino-tectal projeksjon og eksemplifisere sin anvendbarhet ved å vurdere Mn 2 + avhengige forbedring av signal i henhold naive og ulike neurodegenerering forhold. Vår protokollen legger spesiell vekt på MR datainnsamling i en moderat 3 T magnetfelt som er generelt mer tilgjengelig enn dedikerte dyre skannere. I naive mus, illustrerer vi hvordan kanalen spesifikke signalintensitet kan være betydelig og reproduserbart bli økt etter intravitreal (ivit) Mn 2 +-programmet. Kvantitativt, Mn 2 + forplantning langs visuell projeksjon oppstår uavhengig av den normale aldringsprosessen (målt mellom 3 og 26 måneder gamle mus) og styrking er ildfast til visuell stimulering og tilpasning til mørket. I kontrast, Mn <sopp> 2 + berikelse i thalamic og midthjernen sentrene er redusert etter akutte PÅ klemskade 18 samt i nfkb1 knock-out mus (p50 KO) lider av spontan apoptose RGC død og ON degenerasjon 19. Således, i ekspansjon på konvensjonell histologisk analyse, langsgående MEMRI analyse av individuelle dyr muliggjør profilering av unike kinetikken av neurodegenerative prosesser. Dette skulle vise seg nyttig for studier på neuroprotection og aksonal regenerasjon forbundet med farmakologiske eller genetiske intervensjoner.
MEMRI av det visuelle systemet utvider vanlige nevrobiologiske teknikker for å vurdere funksjonaliteten i henhold naive og patologiske tilstander. Bortsett fra å gi et unikt innblikk i integriteten av en isolert CNS fiberkanal, kan MEMRI lett bli supplert med atferdstester, f.eks, optometri og visuelt basert vann oppgaver, for å undersøke de umiddelbare konsekvensene av et gitt paradigme for visuell persepsjon. Det knytter også elektrofysiologisk og histologiske undersøkelser med funksjonell visuell karak…
The authors have nothing to disclose.
AK er støttet av Oppenheim Foundation og RH er støttet av Velux Foundation. Vi takker I. Krumbein for teknisk og K. Buder for histologisk støtte, og J. Goldschmidt (Leibniz Institute for nevrobiologi, Magdeburg, Tyskland) for teknisk rådgivning på TIMM farging.
Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
Mouse holder | custom made | ||
Red light lamp | |||
Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 |