Складной и характеристика Био-отзывчивого робота от ДНК оригами
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
Наноробота ДНК представляет собой полый гексагональной нанометровый устройство, предназначен для открытия в ответ на конкретные раздражители и настоящим груза поглощенных внутри. Оба раздражители и грузов может быть адаптирована в соответствии с конкретными потребностями. Здесь мы описываем протокол изготовления нанороботов ДНК, с использованием техники ДНК-оригами. Порядок инициирует путем смешивания короткие однонитевые скобы ДНК в акционерное смеси, которая затем добавляется к длинному, круговой, одноцепочечной ДНК эшафот в присутствии складной буфера. Стандартный термо циклер запрограммирован, чтобы постепенно снизить температуру реакции смешивания для облегчения отжиг скобы к эшафот, который является руководящей силой позади складывания нанороботов. После завершения реакции складывания 60 ч завершена, избыток скобы отбрасываются с использованием центробежного фильтра, а затем с помощью визуализации агарозном гель-электрофореза (возраст). Наконец, успешное изготовление на нанороботов проверяется методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ),с использованием уранила формиата-как негативный краситель.
Introduction
Использует для нуклеиновых кислот нанотехнологий поразительны. Уступчивость базовой спаривания Уотсона-Крика, а также легкость и относительная низкая стоимость крупномасштабного синтеза заказных олигонуклеотидов 2 породила взрыв приложений 3 и исследований в области нанотехнологий ДНК. Структурно ДНК нанотехнологии, основанный на неподвижной распределительной Seeman 4,5 качестве фундаментального строительного блока использует ДНК в качестве самосборки элементарной единицы для строительства произвольной формы 6-8.
Недавнее развитие scaffolded ДНК оригами 9 методика позволяет на строительство сложных 2D / 3D нано-архитектур 10-12 с точностью субнанометровым и является эффективным путем для строительства новых функциональных объектов с увеличением сложности и удивительной разнообразия. Процесс строительства основан на длинные лесов однонитевой ДНК, как правило, получают из генома вирусногое, которые могут быть сложены через гибридизации сотен коротких одиночных олигонуклеотидов ДНК называют цепь скрепки. Высокая структурная разрешение получаемых с помощью этого метода является прямым результатом естественных размеров двойной спирали ДНК, в то время как воспроизводимость изготовления является результатом адаптации короткие однонитевые последовательности скрепками, чтобы облегчить максимальной взаимодополняемости водородной связи достижимо. При использовании медленного отжига нарастить проектную наименьшей энергией, термодинамически более предпочтительным наноструктуры достигается с высоким выходом и верности. Простой реализация правил проектирования распределительных в компьютерном коде позволили разработать САПР, таких как caDNAno 13, что чрезвычайно упрощает задачу проектирования больших и сложных структур, содержащих сотни связанных переходов.
Ранее мы описали конструкцию нанороботов ДНК с помощью инструмента 14,15 caDNAno. Здесь мы изобразить изготовление ивизуализации, с помощью электронной микроскопии (ПЭМ), в нанороботов, 3D-полой шестигранной наноустройства, с размерами 35 х 35 х 50 нм 3, предназначен для прохождения основной конформационные изменения в ответ на заранее определенных стимулов и настоящей конкретного груза, например как белки или олигонуклеотиды нуклеиновых кислот, поглощенных внутри. В то время как 12 загрузочные станции доступны внутри полого корпуса, фактическое количество связанного груза отличается от размера груза. Молекулы Грузовые от небольших молекул ДНК ферментов, антител и 5-10 нм наночастиц золота. Cargocan либо быть однородной или гетерогенной, так что каждый нанороботов содержит смесь различных молекул. Зондирования достигается с помощью двух двуспирально замок ворот дизайна ощутить белки, нуклеиновые кислоты и другие химические вещества, основаны либо на aptasensor 16,17 или нити ДНК смещения 18 технологий. Последние события в аптамеров протоколов отбора 19-21 включить дизайн нанороботов отвечаяво все возрастающей диапазоне молекул и клеточных типов.
Ранее работа показала наноробот несущий специфические антитела, которое при связывании со своим антигеном может передавать либо ингибирующий или плодовитых сигнал к внутренней части специфических типов клеток в смешанной популяции клеток 15. Захватывающая особенность этих наноустройств является их способность выполнять даже более сложные задачи и логика управления с введением различных подтипов нанороботов в одной популяции. Недавно мы показали, конкретные подтипы нанороботов, осуществляющих как положительные или отрицательные регуляторы, контролируя население эффекторной содержащий активную молекулу грузов 22.
Протокол, представленные здесь описывает изготовление, очищение и визуализации в закрытом нанороботов с последовательностями сенсорных аптамер, которые связывают выборочно PDGF, чтобы облегчить открытие нанороботов 15,22. Процесс изготовления описано аналогичен пПроцесс изготовления anorobot изначально изображен Дуглас и др. 15 с изменениями, направленных на снижение продолжительности процесса в целом, в то время как увеличение ставки доходности и очистки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали изготовление, очищение и визуализацию нанороботов ДНК. После изготовления гексагональной шасси устройства, функция нанороботов запрограммирован с простой внедрения конкретного груза и зондирования нитей на робота, который легко найти их назначенный положение из-за водор?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность С. Дуглас для очень ценные обсуждения и советы, и всех членов лаборатории Бачелет за полезные обсуждения и работы. Эта работа поддержана грантами от факультета естественных наук и Института нанотехнологий и перспективных материалов Университета Бар-Илан.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
Referências
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
