折叠的DNA折纸一个生物反应机器人与表征
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
该DNA纳米机器人是一个中空的六角纳米器件，设计成响应于特定的刺激和本货物内部隔离开。既刺激和货物可以根据具体需要量身定做。在这里，我们描述了DNA纳米机器人制造协议，与使用DNA折纸技术。该步骤首先短单链DNA订书钉混合到原料混合物中，然后加入到长圆形，单链DNA的支架中的折叠缓冲液中的存在。一个标准的热循环仪被编程，以逐渐降低所述混合反应温度，方便钉到脚手架退火，这是纳米机器人的折叠背后的导向力。一旦60小时折叠反应完成后，过剩的钉被使用离心过滤器，接着经由可视琼脂糖凝胶电泳（AGE）丢弃。最后，将纳米机器人的制造成功是由透射电子显微镜检验（TEM）与使用双氧铀酸盐作为负染色。
Introduction
的用途核酸纳米技术是惊人。在Watson-Crick碱基配对的易处理性以及大规模合成的定制寡核苷酸2的易用性和相对低的成本已生成的应用3中的DNA纳米技术领域的爆炸和研究。结构DNA纳米，基于所述不动的塞曼结4,5-作为基本构建块利用的DNA，作为任意形状6-8的结构的自组装基本单位。
脚手架DNA折纸9技术的最新发展使得复杂的2D / 3D纳米结构10-12亚纳米级精度的建设，是建设新的功能对象日益增长的复杂性和惊人的多样性的有效途径。施工过程是基于一个长脚手架单链DNA，通常是从病毒染色体组衍生即，它可以通过几百短单链DNA寡核苷酸的杂交被折叠称为订书钉。通过这种技术获得的高结构分辨率是DNA双螺旋的自然尺寸的直接结果，而制造的再现性剪裁短单链订书钉序列以促进最大的氢键互补达到的结果。与使用慢温度退火的斜坡设计最低能量，热力学优选的纳米结构中达到高的产率和保真度。在计算机代码轻松实现连接处的设计规则允许的CAD工具，如caDNAno 13的发展，也极其简化设计包含数百个路口相连的大，结构复杂的任务。
先前我们描述的DNA纳米机器人的设计与caDNAno工具14,15的助剂。在这里，我们描述的制造和可视化，通过透射电子显微镜（TEM），所述纳米机器人，一个三维空心六角纳米器件，具有尺寸为35×35×50纳米的三件设计成经受到预定刺激和本具体货物中，响应一个主要的构象变化，例如蛋白质或核酸的寡核苷酸，隔离内部。虽然12装载站可在空心机箱内部，束缚货物的实际数量与不同尺寸的货物。货物分子范围从小型DNA分子的酶，抗体和5-10纳米金纳米颗粒。 Cargocan要么是均匀的或异质的，使得每个纳米机器人包含不同的分子的混合物。感测通过两个双螺旋锁定门设计实现成感测蛋白质，核酸或其它化学品，或者基于适体传感器16,17或DNA链置换18的技术。在适体选择的协议19-21最近的事态发展使纳米机器人的设计响应到分子和细胞类型的不断增加的范围。
早期的工作表明一个纳米机器人携带的特异性抗体，其在结合其抗原可以中继既抑制性或多产的信号，以特定的细胞类型的内部以混合细胞群15。这些纳米器件的一个令人兴奋的特性是他们与一个单一的群体推出不同的纳米机器人亚型的执行更为复杂的任务和逻辑控制能力。最近，我们证明了在执行作为正或负调节纳米机器人的特定亚型，控制含活性货物分子22的效应器群体。
这里介绍的协议描述门控与选择性结合的PDGF以促进纳米机器人15,22的开口适体传感器序列的纳米机器人的制造中，纯化和成像。中描述的制造过程类似于n个anorobot制造工艺最初由Douglas 等人 15的变化旨在减少整个过程持续时间所描绘的，同时增加了产率和纯化率。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们介绍的加工，净化，和可视化的DNA纳米机器人的。继装置的六边形底盘的制造中，所述纳米机器人的功能进行编程时将简单介绍的特定货物和传感链到机器人容易地找到它们的指定的位置，由于氢键互补可用单链对接位点14 ，15,22。
描述的制造协议使用缓慢退火坡道，其通常使用在我们的实验室折叠广泛折纸形状。如果生产时间成为关键因素的其它协议，如由Sobc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢S.道格拉斯极有价值的讨论和建议，以及巴切莱特实验室的所有成员有益的讨论和工作。这项工作是由生命科学学院和纳米技术及先进材料研究所在巴伊兰大学的资助。
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
Referências
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
