Tranche de cerveau Biotinylation: Une<em> Ex Vivo</em> Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones
Summary
Trafic membranaire neuronal contrôle dynamiquement la membrane plasmique disponibilité des protéines et un impact significatif sur la neurotransmission. À ce jour, il a été difficile de mesurer le trafic endocytose neuronale dans les neurones adultes. Ici, nous décrivons une méthode très efficace, quantitative pour mesurer les changements rapides dans l'expression des protéines de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée.
Abstract
Traite endocytose régulée est le mécanisme central faciliter une variété d'événements de neuromodulation, en contrôlant dynamiquement récepteur, canal ionique, et le transporteur cellule présentation de surface à l'échelle minutes de temps. Il ya une grande diversité de mécanismes qui contrôlent le trafic endocytose de protéines individuelles. Les études portant sur les fondements moléculaires de la traite ont principalement invoqué biotinylation de surface à mesurer quantitativement les changements dans la protéine de membrane expression de surface en réponse à des stimuli exogènes et la manipulation génétique. Cependant, cette approche a été limitée principalement à des cellules en culture, qui peuvent ne pas refléter fidèlement les mécanismes physiologiquement pertinents en jeu dans les neurones adultes. En outre, les approches de cellules en culture peuvent sous-estimer les différences spécifiques à la région dans les mécanismes de la traite. Ici, nous décrivons une approche qui s'étend biotinylation de la surface cellulaire pour la préparation de tranches de cerveau aiguë. Nousdémontrer que cette méthode offre une approche de haute fidélité pour mesurer les changements rapides dans les niveaux de surface de la protéine de la membrane des neurones adultes. Cette approche est susceptible d'avoir une large utilité dans le domaine du trafic d'endocytose neuronale.
Introduction
Le trafic est un mécanisme d'endocytose cellulaire ubiquitaire qui affine le plasma présentation membranaire d'une variété de protéines membranaires intégrales. L'endocytose fournit des nutriments essentiels pour le milieu intracellulaire et une désensibilise la signalisation du récepteur en réponse à l'activation du récepteur 2. Endocytose recyclage en arrière de la membrane plasmatique peut en outre améliorer la signalisation cellulaire par l'augmentation des niveaux d'expression de protéines à la surface de la cellule 3. En outre, les perturbations de trafic membranaire sont impliqués dans de nombreuses maladies et conditions pathologiques 4,5, soulignant la nécessité d'étudier les mécanismes moléculaires qui gouvernent la protéine endocytose trafic. Alors que de nombreuses protéines utilisent des mécanismes d'internalisation de clathrine dépendante classiques, des preuves de montage au cours des dernières années démontre que les mécanismes d'endocytose clathrine indépendant multiples régissent le potentiel endocytose d'une gamme croissante deprotéines 6,7. Ainsi, la nécessité d'étudier les mécanismes d'endocytose facilitant la traite des systèmes physiologiques pertinentes a considérablement augmenté.
Dans le cerveau, le trafic d'endocytose des récepteurs, canaux ioniques et transporteurs de neurotransmetteurs joue un rôle primordial dans l'établissement de la plasticité synaptique 8-11 et la réponse aux drogues d'abus 12-15, en fin de compte un impact de l'excitabilité neuronale et les réponses synaptiques. À ce jour, la majorité des études de trafic neuronales compter sur des systèmes d'expression hétérologues ou neurones primaires en culture, qui ne peut refléter de façon fiable les mécanismes en jeu dans les neurones adultes. Nous rapportons ici une approche qui utilise biotinylation de surface à mesurer quantitativement les niveaux de protéines de surface dans des tranches de cerveau de courte durée provenant de rongeurs adultes. En utilisant cette approche, nous présentons des données qui démontrent que le transporteur de la dopamine du striatum de souris intériorise rapidement reréponse à phorbol ester à médiation par la protéine kinase C (PKC) activation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré la connaissance de longue date que le trafic endocytose critique impacts de signalisation synaptique dans le cerveau, il s'est avéré difficile de mesurer quantitativement les changements dans l'expression des protéines de surface des neurones adultes. Dans ce travail, nous rapportons une approche fiable pour étiqueter la protéine de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée. préparations de tranches de cerveau ont une longue histoire d'utilité pour les enregistreme…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le NIH subventions DA15169 et DA035224 à HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
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