大脑切片生物素化：一个<em>前体内</em>方法来衡量地区特有的质膜蛋白贩运成年神经元
Summary
神经元膜贩运动态控制细胞膜蛋白的可用性和显著影响神经传递。迄今为止，它已经挑战来衡量成人的神经元的神经元内吞贩运。在这里，我们描述了一个非常有效的，量化的方法来衡量在急性脑切片的表面蛋白表达体外快速变化。
Abstract
调节内吞贩运是中央机制，促进多种神经调节活动，通过动态控制在分钟时间尺度受体，离子通道和转运细胞表面呈现。还有就是控制个别蛋白质的内吞机制拐卖了广泛的多样性。研究调查贩卖人口的分子基础主要依赖于表面生物素定量测量响应外源性刺激和基因操作改变膜蛋白的表面表达。然而，这种方法已被主要限于培养的细胞，这可能不是忠实地反映在游戏中成年神经元的生理学相关的机制。此外，培养细胞的方法可能低估贩运机制特定地区的差异。在这里，我们描述了一个扩展的细胞表面生物素的急性脑片制备的方法。我们表明，该方法提供了高精确度的方法来测量在膜表面蛋白水平的快速变化在成年神经元。这种方法可能在神经元内吞贩运领域广泛的实用性。
Introduction
内吞贩运是微调的各种整合膜蛋白的细胞膜呈现一个无处不在的细胞机制。内吞作用提供重要的营养物质向细胞内环境1和麻痹受体信号响应受体激活2。内吞再循环回至质膜可以通过增加蛋白质的表达水平在细胞表面3还增强细胞信号传导。此外，膜运输扰动有牵连的许多疾病和病理条件下4,5，强调需要调查支配蛋白质内吞贩运分子机制。而许多蛋白质利用经典的网格蛋白依赖的内化机制，越来越多的证据，在过去数年证明了多个网格蛋白独立的内吞机制支配的增加数组的内吞潜在蛋白质6,7。因此，有必要探讨促进生理系统有关拐卖的内吞机制已有很大的增长。
在大脑中，受体，离子通道和神经递质转运蛋白的内吞贩运在建立突触可塑性8-11和应对滥用药物12-15，最终影响神经细胞的兴奋性和突触反应的基础性作用。两者都不迄今为止，大多数神经元拐卖的研究都依赖于异源表达系统或原代培养的神经元，可以可靠地反映在作怪成年神经元的机制。在这里，我们报告说，使用表面生物素定量测量表面蛋白水平在成年啮齿类动物源性急性脑切片的方法。使用这种方法，我们提出了证明小鼠纹状体多巴胺转运蛋白迅速内化在数据重响应对佛波酯介导的蛋白激酶C（PKC）的活化。
Protocol
所有的动物处理和组织收获是按照美国马萨诸塞大学医学院实验动物管理使用委员会大学（IACUC）的指引进行，继批准的协议＃A1506（Melikian，PI）。 所需的解决方案 人工脑脊液（学联） -使每日新鲜 125 mM氯化钠，2.5 mM的氯化钾，1.2毫米的NaH 2 PO 4，1.2毫摩尔MgCl 2，2.4 mM的氯化钙</s…
Representative Results
神经元的多巴胺转运蛋白被内响应于PKC活化在细胞系16-20。尽管许多报告表明在各种细胞系和表达系统的PKC诱导的DAT表面的损失，已经具有挑战性证实这一发现在培养的多巴胺能神经元21-23。我们用小鼠纹状体切片直接测试DAT是否内化响应于PKC活化在成年多巴胺能神经元。以下切片制备，切片沿着从相同平面上的中线和切片切成对半收治±1μM佛波醇肉豆蔻酸酯-13乙酸酯（PMA）处理30…
Discussion
尽管长期以来知识内吞贩卖大脑危重影响突触信号，它已被证明具有挑战性的定量测量在成年神经元中的变化的蛋白质的表面表达。在这项工作中，我们提出一个可靠的方法来治疗急性脑片表面标记蛋白体外 。脑片制剂有实用的电生理记录的悠久历史，因为他们保持突触连接和细胞存活率高达小时的准备后。另外，切片的策略可以进行优化，以保持各种感兴趣的大脑区域之间的特定突触连…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院资助DA15169和DA035224到下摆
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
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Citar este artigo
Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).