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Neurociência

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Published: June 15, 2014
doi:
10.3791/51219
, ,
1Regenerative Medicine Institute,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Abstract

Ein Zellexpansion Technik, um eine große Zahl von Zellen, die aus einer einzelnen Probe für Forschungsexperimente und klinische Studien sammeln würde die Stammzell Gemeinschaft profitieren. Viele aktuelle Erweiterung Methoden sind aufwendig und teuer, und solche, die vollständige Dissoziation kann dazu führen, mehrere Stamm-und Vorläuferzelltypen, die Differenzierung oder frühen Seneszenz. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen automatisierten mechanischen Passagieren Verfahren als "Hacken", das einfach und kostengünstig ist bezeichnet entwickelt. Diese Technik vermeidet chemische oder enzymatische Dissoziation in Einzelzellen und ermöglicht die großflächige Erweiterung des suspendiert, Sphäroid-Kulturen, die konstant Zell / Zell-Kontakt zu halten, statt. Die Schneideverfahren hat sich vor allem für fötale Gehirn-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen oder Neurosphären verwendet wurden, und wurde kürzlich für die Verwendung mit neuronalen Stammzellen aus embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen veröffentlicht. Das Verfahren involves Aussaat Neurosphären auf einer Gewebekultur Petrischale und anschließend vorbei einen scharfen, sterilen Messer durch die Zellen effektiv die Automatisierung der mühsame Prozess der manuell mechanisch distanziert jede Kugel. Suspendieren der Zellen in der Kultur ein günstiges Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis; wie mehr als 500.000 Zellen können in einer einzelnen Neuro von weniger als 0,5 mm im Durchmesser wachsen. In einem Kolben T175 kann über 50 Millionen Zellen in Suspensionskulturen wachsen im Vergleich zu nur 15 Millionen in adhärenten Kulturen. Wichtig ist, dass das Hackverfahren gemäß der aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) eingesetzt, wodurch Massenmenge Produktion von klinischem Zellprodukte.

Introduction

Es gibt eine lange Geschichte der Erweiterung Nagetier neuralen Stammzellen in Kultur entweder als Monoschicht oder allgemeiner Neurosphären 1-3 4-7. Zusätzlich wurden menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems zu entwickeln 8-17 isoliert in vitro expandiert wurden. Diese Zellen sind bi-potent, und zur Differenzierung zu beiden Astrozyten und Neuronen und haben ein sehr nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der neuralen Entwicklung 18,19 und 20,21 Krankheitsmechanismus. hNPCs sind auch in vielen verschiedenen Tiermodellen der Krankheit des zentralen Nervensystems mit unterschiedlichen Stufen der Integration, das Überleben und die funktionalen Wirkungen 22-24 verpflanzt worden.

Oft epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und / oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) 25-28 – – und beide haft 29 und drei Traditionell Nagetier oder menschliche fötale NSC an Wachstumsfaktoren ausgesetztSphäroid-dimensionalen Systemen werden typischerweise unter Verwendung der enzymatischen Spaltung in eine Einzelzellsuspension 30-34 agiert. Die Standard-Methode, um Zellen für die Forschung oder die klinische Anwendung zu erweitern ist als Anhänger Monoschicht durch einfache Manipulation. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Passage Mono und Neurosphäre hNPCs mit enzymatische oder chemische Lösungen, führte im frühen Seneszenz 35. Darüber hinaus kann die enzymatische Spaltung bei erhöhten Differenzierung und karyotypischen Anomalien anhand von Daten mit embryonalen Stammzellen 36-38 gezeigt, führen. Obwohl die Standardmethode der Passage hat hNPCs aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) hochwertige Produkte, die in Phase 1 der klinischen Studien (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.) gegangen produziert, erlaubt die Methode nur ein paar Runden Zellamplifikation, die Begrenzung der Bank Potenzial.

Natürlich könnte große Forschungsexperimente und zukünftigen klinischen Studien von der Möglichkeit profitierenpropagieren Zellen in der Masse und mit verzögerter Seneszenz zu großen Wachstums-und Zellbanken zu ermöglichen. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir ein neues und automatisierten Weise mechanisch Passage intakter Neurosphären durch "Zerhacken" sie in kleinen Clustern auf Zell-Zell-Kontakt. Dieses Verfahren stark erhöht deren Lebensdauer 39 und Suspensionskultur ermöglicht eine effizientere Nutzung der Inkubator Platz im Vergleich zu Monolayer-Kulturen, wie bei einem alternativen 3D-Bioreaktor-Kultur-Methode 40 gesehen. Die zur Verfügung gestellten Hack-Protokoll ermöglicht die Produktion von großen Banken von einem fetalen Probe größer als Durchgang 10, eine unwahrscheinliche Leistung mit Standard-Methoden Passagieren. Während diese Methode für das Passagieren hNPCs ist unkonventionell, wird er immer beliebter, und wurde vor kurzem mit anderen Zelltypen wie neuronale Stammzellen aus menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen, so dass groß angelegte Erweiterung für verschiedene Anwendungen, einschließlich in v veröffentlichtitro Krankheit Modellierung 41-46. Wichtig ist, dass ein cGMP-grade hNPC Zellbank bereits mit dem Schneideverfahren hergestellt wurde, zeigt, dass die Technik zur zukünftigen klinischen Anwendungen verwendet werden.

Protocol

1. Ethische Erklärung und Sicherheit Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung von Zellkulturprodukte von Menschen oder Tieren. Alle abgeleiteten Gewebe müssen vor Gebrauch mit dem entsprechenden Institutional Review Board (en) und / oder der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (n) genehmigt werden. Alle Bio-gefährliche Abfälle müssen nach den auf der jeweiligen Institution entschieden Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden. Kennen und befolgen Sie alle Sicherheits-und treffende…

Representative Results

Abbildung 5. Repräsentative Daten. A) Projizierte Zellzahlen von hNPCs an p19 eingefroren, aufgetaut und dann als Anhänger Monolayer mit enzymatischen Dissoziation im Vergleich zu Neurosphären über den Hack Verfahren agiert erweitert. Tag 0 stellt, wenn die Zellen aufgetaut p20 bei B.) Repräsentative Bilder von Kugeln vor, hacken, 10…

Discussion

Fig. 6
Abbildung 6. Chopping Schema. Erweiterung Sphäroid Stammzellen / Vorläuferzellen in Kultur mit Hilfe der mechanischen Hackmethode.

Kritische Schritte

Eine Übersicht des Hackexpansions Paradigma ist in Fig. 6 gezeigt. HNPC Kugelgröße ist einer der wichtigen Kriterien, die bei Pa…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Soshana Svendsen für kritische Überprüfung und Bearbeitung des vorliegenden Berichts. Diese Arbeit wurde durch das NIH / NINDS 1U24NS078370-01 und CIRM DR2A-05320 zu beigetragen.

Materials

Beaker, 50 mL Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer  Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X) Life Technologies 12563-011
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Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).
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