Во время эмбрионального развития головного мозга, проекционные нейроны коры головного мозга генерируются в вентрикулярной зоне, псевдомногослойный эпителий состоит из различных типов нейронных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), что линии боковые желудочки. Среди NSPC, радиальные глиальные клетки (RGC), которые служат нервных стволовых клеток, претерпевают интеркинетической ядерного миграции (INM): они выполняют митоз на поверхности желудочка и S-фазе при базальном предела вентрикулярной зоне (ВЗ) ^{1, 2,3.} Они могут разделить либо симметрично, чтобы генерировать два RGC или асимметрично, чтобы генерировать один RGC и один нейрон или промежуточной клеток-предшественников (IPC) ^{4, 5.} МПК мигрировать в слое покрывающей пролиферирующих называемой субвентрикулярной зоне (SVZ), где после одного последнего симметричного деления они создают два незрелых проекционные нейроны ^6-8. Вопреки РГК, МПК не подвергаются INM (обзор в ^9). Вновь созданный нейроны Migrели радиально вдоль радиальных волокон через промежуточную зону (ИЗ), чтобы достичь конечного пункта назначения в кортикальной пластинки (СР) ^{10, 8.} Идеальное время всех этих событий имеет важное значение для правильного развития коры. Например переход от распространения в дифференциации нервных населения предшественников контролируется продолжительности G1 фазы ^{11, 12.} Таким образом, удлинение фазе G1 коррелирует с клеточной дифференцировки.

Генотоксический стресс, такие как ионизирующего излучения, строго отрицательно воздействовать на развитие головного мозга (обзор ^13). Мы и другие показали, что NSPC весьма склонны к радиационно-индуцированного апоптоза ^{14 15,16.} Ионизирующих излучений вызывать ДНК двойные разрывы цепи, которые являются наиболее серьезный ущерб пролиферирующих клеток. Один из важнейших компонентов повреждения ДНК реагирования (РДР) в велосипедных клеток является активация контрольно-пропускных пунктах клеточного цикла в / M переходов G1 / S или G2 или во время Sфаза (внутри-S контрольно-пропускной пункт) ^17-21. Они блокируют прогрессирование клеточного цикла, чтобы предоставить время для ремонта повреждений ДНК или ликвидации слишком поврежденных клеток. Следовательно, гибель клеток, а также ход клеточного цикла задерживается может изменить развитие мозга в ответ на ионизирующего излучения экспозиции ^22-24. Таким образом, было интересно разработать метод оценки активацию клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов в NSPC в облученной мышиных эмбриональных мозга.

Прогрессирование клеточного цикла следует регулярно использующих включение тимидина аналоговых, 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU). BrdU вводят во время S-фазе клеточного цикла, когда ДНК репликацию. Использование антитела против BrdU позволяет впоследствии обнаружение клеток, которые были в S фазе в течение импульса BrdU.

Новый аналог тимидина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина (ОБР) детектируется посредством флуоресцентного азида. Различные способы обнаружения EDU и В РДУ не перекрестно реагируют ^25, что позволяет одновременное обнаружение обоих аналогов тимидина, что полезно для изучения клеточного цикла. Обычно клетки сначала импульсно Edu, а затем импульсно BrdU, где время между обеими инкорпорации длится пару часов ^{25, 26.} Добавление BrdU в культуральной среде, содержащей ОБР приводит к включению предпочтительно BrdU в ДНК с вытеснением ОБР, в то время как одновременное добавление ОБР ²⁵ с эквимол рным или половина эквимол рном BrdU к результатам медиа только в BrdU включения ^27. Это упрощает двойной протокол маркировки, устраняя шаги мыть, которые обычно требуют, чтобы удалить первую метку из культуральной среды перед добавлением второй этикетке. Это также относится к особый интерес для в естественных условиях исследования, где шаги стиральные невозможно, чтобы определить точные сроки ввода S фазы или выходе из клеточной популяции.

т "> Недавно был предложен способ маркировки двойного импульса в эмбрионального мозга мыши с использованием ОБР и BrdU ^{23, 24,22} была разработана для анализа прогрессии клеточного цикла и INM из NSPC после облучения в матке. Более того было показано, что в ходе S фазы, клетки мыши повторить вначале Эухроматин регионы и затем перицентрического гетерохроматина ^28,29,30. Интересно, перицентрический гетерохроматина разных хромосом сосредоточены в интерфазовыми ядер с образованием гетерохроматиновых очаги также известный как хромоцентров и легко обнаруживаемый окрашиванием DAPI как яркий очагов. Таким образом, дифференциальные EDU и BrdU окрашивание из эухроматина и хромоцентров помогли нам проанализировать точнее S фазы прогрессирования NSPC.

Этот метод позволил демонстрацию очевидного отсутствия G1 / S контрольно-пропускном пункте в НМТП ^22-24, что вполне удивительно, так как это контрольно-пропускной пункт, как предполагается, является критическим для стабильности генома. Несколько ехрerimental проекты, основанные на различных комбинациях EDU и BrdU импульсов были использованы для анализа прогрессию клеточного цикла в брюшной и спинной мозге. Здесь мы приведем пример протоколов, позволяющих изучение острого повреждения ДНК NSPC в течение первых 4 часов следующего внутриутробное облучения эмбрионов E14.5 мыши.