高效的生产和纯化重组小鼠Kindlin-3从昆虫细胞生物物理研究

这个协议假定鼠标kindlin-3基因（FERMT3）已成功地克隆到很晚P10启动子的下游，并且该载体具有侧翼序列的杆状病毒，以允许重组的杆状病毒质粒BAC10 KO一个矢量：1629通过IM琼斯开发和同事28。对于本方案来说，kindlin-3基因被克隆到pOPINE 29和所使用的引物和克隆策略，可以发现在别处12所述。该质粒被工程化以使FERMT3基因（kindlin-3）是P10杆状病毒启动子的控制下与载体包含5'UTR/ORF603和ORF 1629和编码的C-末端His 6 -标签对下游的纯化29。 1。昆虫细胞培养和维护之前的重组杆状病毒的扩增，适于悬浮培养（Sf9细胞） 草地贪夜蛾细胞应生长和维持。 昆虫细胞应该总是使用一个专门的组织培养通风柜无菌技术处理。 昆虫细胞的悬浮培养物培养于SF-900 II（SFM），补充有100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的培养瓶中于27℃下用100rpm振荡下的无血清液体培养基中。 保持在昆虫细胞培养物的密度范围在1×10 6 – 1个10 7个细胞/ ml通过拆分并用新鲜的SF-900 II介质稀释的细胞培养物。 注意：健康 细胞应该看起来均匀的尺寸，应该是球形的。 使用血细胞计数器和光学显微镜来计算培养细胞密度计数细胞中的样品体积。 2。重组杆状病毒的一代文化与采用SF-900 II介质含100微克/毫升penicilli保持Sf9细胞悬浮n和100微克/毫升链霉素。对于杆状病毒的产生，昆虫细胞，应培养成5×10 5的密度范围- 1×10 6个细胞/ ml。 种子约1×10每孔6 Sf9细胞中的无菌的6孔组织培养板中的2ml SF-900 II介质中补充有100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。离开Sf9细胞在RT在通风柜附着于塑料孔的底部，从而形成一个单分子层。 通过共转染杆状病毒质粒DNA和质粒DNA到单层培养完成重组杆状病毒的产生。 对于每个转染，混合1-2纯化pOPINE-mFERMT3，其中拥有ORF1629杆状病毒元素，用0.5微克纯化BAC10 KO微克：1629在100微升SF-900 II SFM无抗生素（溶液A）。 在一个单独的管，稀释6微升Cellfectin II试剂用100微升SF-900 II SFM无反抗生素对每个转染反应（溶液B）。 A'预混液“可以在这里创建，可降低液体处理，如果许多转染是必需的。 混合两种溶液（A和B，约200微升），并在室温下孵育20分钟，以形成脂质-DNA复合物。 淡化脂质DNA复合物与800μLSF-900 II SFM无抗生素。小心吸出的Sf9细胞单层介质并小心地吸取溶液A / B和媒体上的Sf9单层的顶端。 孵育转染的细胞在湿润的孵化器在27°CO / N和无抗生素的添加进一步1毫升SF-900 II SFM的第二天到每个单层培养。将细胞在27℃延长5天。 直接从培养液中（约2毫升总数）收获重组杆状病毒并转移到一个干净的离心管中（例如一个15毫升的Falcon管中）。 澄清任何的Sf9细胞DEBR是通过离心在1000×g离心5分钟，在室温。的病毒，这是在所得到的上清液，并标为P1，转移至干净的管中并储存于4℃在黑暗中直到使用。在此阶段，剩余的Sf9单层可用于通过评估重组kindlin-3在昆虫细胞中的存在，评估重组病毒的产生。 重悬单层用0.5ml PBS中稀释10微升样品与2×SDS-PAGE上样缓冲液等体积​​。加热该样品在> 95℃下进行至少10分钟。 超声处理的样品为1秒，用微型超声波仪末端10％的幅度，如果它太粘适当凝胶上样。 3。重组杆状病毒的扩增对于病毒在悬浮液中的扩增，用1.4×10 6个细胞/ ml的细胞密度，这应占据总烧瓶体积的1/20（ 即 50毫升培养物中一个2升的烧瓶中）。 通过与P1病毒原料在感染使用下列公式计算的多个0.1（MOI）感染的昆虫细胞培养物达到的重组病毒的扩增; 注：P1病毒产生可以被假定为具有1×10 7 PFU / ml的一个预期病毒滴度。然而，斑块检测可以在此阶段之前进行。 孵育在P1感染的昆虫培养在27℃，以100rpm振荡培养3天（72小时）。 通过离心分离在1000×g离心5分钟，在室温分离介质将细胞收获病毒。通过评估通过SDS-PAGE和蛋白质印迹kindlin-3蛋白表达保存生成的细胞沉淀在这个阶段进行确认重组病毒的生产。 澄清病毒丰富的介质转移到一个干净的试管和储存在4℃黑暗中直到使用。该病毒原料记为P2。 注意：2×10 8 PFU / ml的（或100 PFU /细胞的扩增率）甲病毒滴度可以预期。 4。 kindlin-3在杆状病毒感染的Sf9表达成长的Sf9细胞培养物悬浮液中的足够量在SF-900 II SFM补充有100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，之前的大规模重组kindlin-3的表达，进行纯化。孵育悬浮培养物在27℃下用100rpm振荡和总培养体积：烧瓶中，以1:5的体积比。 感染的Sf9细胞悬浮培养以2×10 6个细胞/ ml的密度。 补充的Sf9培养1％的终浓度（V / V）胎牛血清（FBS），随后与扩增重组病毒（P2-病毒原料）给予的1 MOI。孵育感染的培养在27℃，100rpm振荡。 嘉实recombina在1000×g离心核苷酸kindlin-3-CHIS 6-表达Sf9细胞72小时后的感染通过离心 并存储所得到的细胞沉淀物于-20℃直至使用，或-80℃下长期贮存。 5。重组Kindlin-3的纯化解冻冷冻的杆状病毒感染的昆虫细胞（Sf9昆虫）粒料表达重组kindlin-3在冰上。 重悬解冻细胞沉淀用裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl，pH值7.5，500 mM氯化钠，1％（V / V）吐温20），补充有无EDTA蛋白酶抑制剂混合物和DNase1 1000-2000ü。 注意：可替换地，改性的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中也可以使用，其中NaCl的浓度被调节至500mM，以防止内源性的Sf9细胞蛋白并用于下游纯化固定化金属亲和柱（见下文）之间的非特异性相互作用。 裂解的细胞通过用洗涤剂和VO孵育悬浮细胞rtexing。声处理（40％振幅，10个循环的10秒脉冲，接着用10秒冷却）的样品在冰浴中进一步破碎细胞或备选地使用Dounce匀浆。 澄清离心48,000×g离心1小时，将溶胞产物在4℃下加载得到的上清液到的HisTrap柱（5毫升柱体积）预平衡的裂解缓冲液，在4℃下以1ml /分钟的速率。 注意：可替换地，澄清的裂解物可以用1-5毫升床体积的预平衡的镍琼脂糖珠（ 例如镍琼脂糖凝胶6快速流动）在4℃下1-2小时进行培养。可以通过使用重力流柱的结合步骤之后形成的Ni琼脂糖的柱中。 用洗涤缓冲液10倍柱体积的洗涤塔（50毫摩尔Tris-盐酸，pH为7.5，500 mM氯化钠，10mM咪唑），以除去未结合的蛋白。 使用AKTA FPLC来洗脱使用从10-500毫米的线性咪唑梯度为10mM /毫升（或在10个柱体积）的速率绑定的重组kindlin-3-CHIS 6。 分馏的洗脱到使用AKTA FPLC 0.5-1毫升馏分，用那些含有kindlin-3-CHIS 6通常洗脱，在300 mM的咪唑浓度的馏分。 通过SDS-PAGE评估洗脱的蛋白质组合物和首次纯化使用抗His 6抗体或抗小鼠kindlin-3抗体通过Western印迹证实。 普尔含有kindlin-3和缓冲液交换成20mM的Tris-盐酸，pH为7.5，200 mM氯化钠通过一系列的稀释液为缓冲液和样品的浓度使用离心浓缩蛋白具有50 kDa的分子量截止（MWCO）的级分在4℃下注：此外，使用滑入式A-仪透析盒为30 kDa的截留分子量透析的蛋白质溶液在4℃4小时，以O / N为20毫米的Tris-HCl，pH值为7.5，200 mM氯化钠。 注意：对于离子交换（见下文）的NaCl的浓度较低， <e米>即50毫米，可与已被用于此步骤。 应用缓冲交换蛋白溶液涂布使用AKTA FPLC以0.5ml /分钟的速度预平衡的HiTrap肝素HP柱（5毫升柱体积）。 注意：绑定kindlin-3中相同的缓冲液用线性NaCl梯度（0.2 M氯化钠至1M NaCl）中，于10毫/毫升的速率增加洗脱。 Kindlin-3-CHIS6有望洗脱在〜0.6 M氯化钠。 分馏的洗脱入0.5-1毫升的级分，并在适当时评估通过SDS-PAGE和免疫印迹的蛋白质组合物，。 注意：人们可以期望的接近95％的蛋白质纯度，如评估通过SDS-PAGE。 池馏分含有kindlin-3和集中使用离心机浓缩蛋白具有50kDa的截留分子量，以0.5-2毫升的最终体积。 在最后的步骤中，研磨的浓缩的蛋白质和缓冲用尺寸排阻色谱法（SEC）交换蛋白。 应用纯化蛋白到苏perdex S200（16/60）或（10/30），以1毫升/分钟或0.5ml /分钟取决于柱尺寸的比率预平衡在20mM的Tris-HCl，pH值7.5，200 mM氯化钠，1mM DTT的使用。 注：在磷酸缓冲盐水（PBS）中，如果需要的尺寸排阻色谱法，也可以进行。 根据大小通过将缓冲在柱上以1毫升/分钟或0.5ml /分钟，这取决于所用的列大小的速率纯化蛋白质。 注：蛋白质从柱上洗脱分馏和监视用280nm处的吸光度。 一个单一的吸收峰应该从SEC，这是分馏并通过SDS-PAGE进行评估，以确定均匀性，通常是> 95％纯后此步骤可以预期的。 浓缩纯化kindlin-3-CHIS 6用离心机浓缩蛋白具有50kDa的截留分子量，以〜15毫克/毫升，作为使用的109320 M A计算的消光系数（ε）评估分光光度计-1厘米-1 </ SUP>（假设所有半胱氨酸残基被还原）。 对于存储在-20℃下和长期贮存于-80℃，等分试样的蛋白质进入PCR管和闪蒸冷冻在液氮中的样品。或者，该蛋白可直接使用多种生物化学和生物物理技术用于调查。