O RNA total de alta qualidade foi preparado a partir de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser após a coloração de seções da medula espinhal com Azure B em 70% de etanol. RNA suficiente (~40-60 ng) é recuperado de 3.000-4.000 neurônios motores para permitir a análise de RNA a jusante por RNA-seq e qRT-PCR.
A preparação do RNA de alta qualidade a partir de células de interesse é fundamental para análise precisa e significativa das diferenças transcricionais entre os tipos celulares ou entre o mesmo tipo celular em saúde e doença ou seguindo tratamentos farmacológicos. Na medula espinhal, tal preparação a partir de neurônios motores, alvo de interesse em muitas doenças neurológicas e neurodegenerativas, é complicada pelo fato de que os neurônios motores representam <10% da população celular total. A microdisseção de captura a laser (LMD) foi desenvolvida para resolver esse problema. Aqui, descrevemos um protocolo para recuperar rapidamente, congelar e seção da medula espinhal do rato para evitar danos ao RNA por RNases endógenos e exógenos, seguido de coloração com Azure B em 70% de etanol para identificar os neurônios motores, mantendo a RNase endógena inibida. LMD é então usado para capturar os neurônios manchados diretamente no tampão de lise de tiocianato guanidine, mantendo a integridade do RNA. Técnicas padrão são usadas para recuperar o RNA total e medir sua integridade. Este material pode então ser usado para análise a jusante das transcrições por RNA-seq e qRT-PCR.
Em tecidos mamíferos compostos por vários tipos de células diferentes, o advento da instrumentação de microdissecção de captura a laser (LMD) proporcionou a possibilidade de selecionar um tipo celular específico para análise no nível de RNA ou proteína. Atualmente, as técnicas de amplificação e sequenciamento de próxima geração permitem o uso de um pool de RNA total de alguns milhares de células para obter um inventário relativamente minucioso do transcriptome, incluindo avaliação dos níveis relativos de RNAs e identificação de várias formas emendadas. Até o momento, as análises proteômicas de alguns milhares de células chegarão apenas a espécies mais abundantes. Por exemplo, identificamos <1.000 das proteínas mais abundantes de 3.000-4.000 corpos de células de neurônios motores (não mostrados), e Zhu e colegas de trabalho relataram recentemente identificar 2.665 proteínas de ~15.000 células tumorais1. Com mais desenvolvimentos da espectrometria de massa, no entanto, é provável que tais análises se estendam a uma profundidade muito maior.
Aqui, apresentamos um protocolo específico utilizado para LMD de corpos celulares neurônios motores da medula espinhal de camundongos, seguido pela preparação do RNA. Este protocolo foi utilizado no contexto da comparação de RNAs de neurônios motores de camundongos transgênicos pré-síndicos superóxido transgênicos (SOD)1 camundongos de esclerose lateral amiotrófica (ELA) com RNAs preparados a partir de uma cepa transgênica sod1 tipo selvagem tanto pela validação RNA-seq e qRT-PCR2. Notavelmente, os neurônios motores, no chifre anterior da matéria cinzenta na medula espinhal, compreendem <10% da população celular total, cercado por um mar de astrócitos, e como tal, seu perfil transcricional não pode ser facilmente desconvolucido de estudos de toda a cordão. Uma abordagem de captura a laser é, portanto, ideal para analisar a expressão de RNA nessas células, com a fisiologia preservada por excisão rápida e congelamento do cabo após breve perfusão salina intracardiac. O neurônio motor somata é grande e, portanto, é facilmente detectável, aqui usando um corante que tem forte afinidade pelos neurônios3. Além disso, com esse tamanho, essas células fornecem uma quantidade relativamente grande de RNA por célula capturada. O procedimento utilizado, conforme detalhado abaixo, poderia ser prontamente ajustado para obter outros tipos de células neuronais, bem como potencialmente outros tipos celulares, especificamente identificados por técnicas de coloração de corantes ou por coloração de anticorpos.
A medida mais significativa de sucesso deste protocolo para a produção de RNA total por microdisseção a laser de fatias de medula espinhal é o valor RIN5. Para amostras de RNA de eucariotes mais altos, valores acima de 8,5 regularmente produzem sequenciamento de alta qualidade e dados qRT-PCR. Se o rendimento for baixo, mas a qualidade for alta, repita a preparação. Se a integridade for menor (mesmo 7,5-8), no entanto, é melhor encontrar a fonte do problema e tentar novamente. Existem muitos passos onde algo pode dar errado, mas na verdade apenas duas fontes do problema – contaminação endógena rnase ou contaminação exógena RNase. O primeiro pode ser abordado pela prática, de modo que o tempo desde o sacrifício do mouse até o congelamento de seu cordão O.C.T-embedded seja minimizado. O outro ponto no protocolo onde o RNase endógeno pode contribuir para um resultado ruim é durante a preparação das fatias. Cada fatia deve aderir a um slide pen de temperatura ambiente rapidamente, mas ele vai derreter (o O.C.T fica claro). Quanto mais rápido a fatia puder ser refrozen, melhor. O criostat que usamos tem superfícies planas dentro da câmara que estão a -20 °C, que usamos para recongelar rapidamente a fatia. Encontre um ponto semelhante no criostat usado e certifique-se de que a fatia se torne opaca novamente rapidamente.
Rastrear fontes de RNase exógeno pode ser difícil, porque há tantas possibilidades. Os únicos reagentes usados que não são expressamente livres de RNase são O.C.T. e o Azure B. Se o Azure B já teve um desempenho satisfatório antes, experimente uma garrafa fresca de O.C.T., embora este reagente nunca tenha sido um problema. Reagentes sem RNase também podem ser substituídos, mesmo de um fornecedor diferente. Uma fonte muito mais provável é o investigador. Além de uma limpeza minuciosa da área de trabalho, muitas vezes é útil ter outro membro do laboratório acompanhando e observando todas as etapas do procedimento. Mesmo que seja alguém que não realiza rotineiramente esse procedimento, um novo conjunto de olhos pode pegar uma fonte de contaminação de outra forma despercebida.
Estender este protocolo para recuperar o RNA de outras células medulares, de células medulares de outras espécies, ou de tipos de células específicas em outros órgãos exigirá modificações em várias áreas destinadas a alcançar a identificação clara das células de interesse enquanto evitam, ou pelo menos minimizam, o impacto do RNase endógeno. No protocolo aqui, a rápida remoção e congelamento do cabo, juntamente com a coloração do Azure B em 70% de etanol, permitiu tanto a minimização da degradação do RNA quanto a fácil identificação dos corpos celulares do neurônio motor. O Azure B é uma mancha histoquímica bem estabelecida para neurônios que parece se ligar ao RNA3 e tem sido usada para avaliar o teor de RNA de neurônios em amostras de autópsia de tecido cerebral de pacientes com doença neurodegenerativa6. Notavelmente, a coloração do Azure B não afetou nem a integridade do RNA purificado nem sua capacidade de ser transcrita e analisada reversa. Outros corantes, como cresylvioleta 7 e azul toluidina8 têm sido usados em protocolos LMD semelhantes. A coleta dos corpos celulares diretamente na solução de tiocianato guanidine à medida que foram dissecadas proporcionou o passo final que resultou na recuperação rotineira do RNA intacto.
Abordagens semelhantes podem ser imaginadas para outras células e órgãos, reconhecendo que identificar as células de interesse ao mesmo tempo em que minimiza ou, preferencialmente, prevenir a degradação do RNA por RNases endógenas é o requisito crítico para uma análise bem sucedida. Em tecidos com altos níveis de RNase, como pâncreas, manuseio rápido e baixa temperatura foram combinados para permitir a recuperação do RNA de células β, aproveitando sua autofluorescência natural para visualização9. Procedimentos com a coloração de anticorpos para identificação também foram relatados10,mas não foram totalmente bem sucedidos em nossas mãos. Finalmente, muitos modelos de camundongos estão disponíveis que expressam proteínas de fusão fluorescente (ou seja, GFP, YFP, RFP) em células de interesse, que poderiam ser usadas para identificá-las em seções de tecido no microscópio LMD. De fato, as cepas de camundongos que analisamos com este protocolo expressam uma proteína de fusão entre SOD1 e YFP11, e seus neurônios motores da medula espinhal são altamente fluorescentes. Não conseguimos, no entanto, encontrar um conjunto de lavagens de etanol e/ou condições de desidratação que removeriam simultaneamente o O.C.T., inibiriam a atividade RNase e consistentemente manteriam fluorescência YFP suficiente para permitir a visualização dos neurônios motores e sua recuperação por LMD. Talvez uma nova proteína fluorescente ou uma variante das disponíveis que mantenha fluorescência em solventes orgânicos possam ser encontradas para superar essa limitação.
The authors have nothing to disclose.
Os autores desejam agradecer a George Farr e aos membros do laboratório de Horwich por discussões úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Médico Howard Hughes.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |