JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Методология эффективного поколения флуоресцентно помеченных вирусных белков Vaccinia

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/51151
, , , , ,
1School of Molecular Bioscience,University of Sydney, 2Department of Medicine,Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science,University of Melbourne

Summary

Быстрый и модульный протокол для генерации рекомбинантных вирусов вакцины, выражаюющих флуоресцентно помеченные белки одновременно с использованием метода преходящее доминирующее отбора описано здесь.

Abstract

Маркировка вирусных белков флуоресцентными белками доказала незаменимый подход к дальнейшему пониманию взаимодействий между вирусом-хозяином. Вирус Вакцины (VACV), живая вакцина, используемая в искоренении оспы, особенно податлив к флуоресцентной живоклеточной микроскопии из-за его большого размера вириона и легкости, с которой он может быть разработан на уровне генома. Мы сообщаем здесь оптимизированный протокол для генерации рекомбинантных вирусов. Определены минимальные требования к целенаправленной гомологичной рекомбинации при репликации вакцины, что позволяет упрощения генерации конструкции. Это позволило альянсу переходного доминирующего отбора (TDS) с флуоресцентным репортером и метаболическим отбором обеспечить быстрый и модульный подход к флуоресцентно этикетке вирусных белков. Упрощая генерацию флуоресцентных рекомбинантных вирусов, мы можем облегчить приложения ниже по течению, такие как расширенный анализ изображений многих аспектов взаимодействия между вирусом и хостом, которое происходит во время репликации вируса.

Introduction

Вирус Вакцинии (VACV) является прототипом вируса оспы и тесно связан с вирусом вариолы, причинным агентом оспы. Оба этих вируса являются членами рода ортопокс, который включает в себя другие заметные патогены, такие как оспа обезьян и вирус ectromelia (mousepox)1. Ортопедические вирусы имеют большие двухтысячие геномы ДНК (180-220 кб), которые кодируют свыше 200 прогнозируемых открытых кадровчтения 2,3. Репликация этих вирусов включает в себя формирование завода перинуклеарных вирусов, где производятся зрелые вирусы (MV), и транс-голги сети, где подмножество MV приобрести две дополнительные мембраны для создания завернутых вирусов (WV) (обзор Робертс и Смит4). Геномы ортопокса очень подразливны для генетических манипуляций из-за высокой степени генетической рекомбинации, которая является особенностью репликации генома VACV и опосредовано вирусной полимеразойДНК 5. Генерация рекомбинантных вирусов опирается на гомологичную рекомбинацию и линейные молекулы ДНК с гомологией всего 12 б.п., достаточной для опосредующей рекомбинации в вакцинии, зараженной вирусомклеток 6. Флуоресцентная маркировка вируса вакцины может дать чрезвычайно яркие частицы вируса из-за большого размера частиц ортопокса, что позволяет включение многих флуоресцентных белков навирион 7. Vaccinia имеет способность нести большие фрагменты инороднойДНК 8 и, кроме того, отсутствие жесткой капсидной симметрии может позволить степень гибкости при выражении вирусных белковых синтезов генов из их эндогенных локусов9. Флуоресцентные метки белков VACV оказались бесценными для изучения взаимодействий хозяина-патогена на субклеточном уровне, особенно в области вступлениявируса 10, транспорта11-13, и морфогенеза, особенно завернутыхвиньонов 7.

Рекомбинантные вирусы могут быть выбраны путем спасения атенуированногофенотипа роста 14,15,метаболический отбор 16-18, или путем выражения гена маркера (например, X-gal19 или флуоресцентный белок 13,20). Здесь мы описываем выбор флуоресцентных вирусов, используя мощное сочетание флуоресцентного и метаболического отбора. Переходные доминирующие векторы отбора (TDS), разработанные Фолкнером и Моссом (1990)21, позволяют интегрировать маркеры вместе с желаемым флуоресцентно помеченным геном интереса. При удалении метаболического отбора может произойти вторичное событие рекомбинации, которое акцизов гена выбора, но оставляет флуоресцентно помечены белка вируса нетронутыми. На рисунке 2 ниже приводится обзор экспериментальной процедуры. Гены выбора, используемые в этом исследовании являются mCherry и Escherichia coli guanine фосфорибозилтрансферазы (gpt) ген, оба выражены из синтетических ранних / поздних вирусных промоутер и используется ранее Cordeiro и др. 22 Кроме того, существует флуоресценция помеченного белка синтеза, представляющий интерес. При снятии метаболического отбора удаляются выбираемые маркеры(mCherry и gpt),оставляя только флуоресценцию помеченного гена, что позволяет идентифицировать правильные рекомбинантные вирусы. Иссечение маркеров выбора дает возможность сочетать несколько флуоресцентных тегов, что позволяет нам создавать вирусы с возможностью флуоресцентно маркировать несколько вирусных белков одновременно. Предыдущие исследования определили минимальные требования гомологии для рекомбинации вакцины линейных и круговых молекул ДНК, трансфицированных в вакцинии вирус-инфицированныхклеток 6. Мы хотели определить эффективность рекомбинации различной гомологии длин фланговых рук в векторе gpt-mCherry TDS путем его включения в вирусный геном вакцины. Было установлено, что гомологичные области 100 bp в векторе TDS достаточны для целевой и опомедленной вставки рекомбинантной ДНК в геном VACV путем гомологичной рекомбинации(рисунок 4). В то время как меньшие длины гомологии также позволили бы рекомбинации, 100 bp гомологии длины при условии достаточно рекомбинантных вирусов, которые могут быть легко определены с метаболическим и флуоресцентным отбора. Фрагменты ДНК такого размера могут быть синтезированы на коммерческой основе при относительно низкой стоимости и значительно облегчают производство нескольких векторов для создания рекомбинантных вирусов. Мы решили увеличить длину гомологии до 150 б.п., чтобы обеспечить большую частоту рекомбинации, сохраняя при этом затраты на синтез олигонуклеотида последовательности фланговых регионов.

Protocol

1. Создание вектора рекомбинации Определите 150 bp длинных фланговых областей гомологии (именуемых левой и правой рукой), необходимых для N- или C-терминно обозначить вирусный ген интереса (см. рисунок 1b). Дизайн олигонуклеотидной последовательности, включающей 150 bp левой и правой руки разделены парой сайтов ограничения выбора. Вся эта последовательность должна также быть окружена второй парой сайтов ограничений (отличается от первой пары), чтобы позволить включение в вектор TDS после синтеза. Позаботьтесь при проектировании олигонуклеотида с ограничениями сайтов, что последовательности находятся в кадре с желаемой вставки сайта. Включите ограничения сайтов между левой и правой рук при проектировании олигонуклеотид для синтеза, который должен соответствовать тем, фланговые открытые рамки чтения флуоресцентных тег выбора (см. рисунок 1b). Можно использовать место ограничения NotI в качестве трех аминокислот связующих между левой рукой и началом флуоресцентного тега. Включите эти же сайты ограничения по обе стороны от флуоресцентного тега PCR (см. рисунок 1c). Клонировать синтезированный фрагмент в вектор TDS. Клонировать флуоресцентный тег в результате рекомбинации вектор с использованием ограничений сайтов между левой и правой рукой регионов гомологии (см. рисунок 1d). 2. Рекомбинантное поколение вирусов В соответствии с рисунком 2, заразить монослой клеток BS-C-1 с вирусом вакцины в сыворотке свободных средств массовой информации при множественности инфекции (MOI) > 1. 1 час после заражения, спасательные клетки с модифицированным орлиным средним Dulbecco (DMEM) и трансфект со смесью плазмидной плазмидной реампиды рекомбинации и трансфекции реагента в соотношении 3:1 в безотхо сыворотке носителя. После 24 часов, соскребать и восстанавливать клетки в DMEM, не содержащие фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и выполнять три замораживания оттепели циклов разорвать открытые клетки и выпустить вирусные частицы. Выполните анализ бляшек с жидким наложением 10% реагентов FBS DMEM и GPT микофеноловой кислоты (25 мкг/мл) и ксантин (250 мкг/мл) следующим образом: Семя 6-хорошо пластины с монослой BS-C-1 клеток. Заразьте 100% монослойными клетками с серийными разбавлениями замерзающих клеток, содержащих вирусные частицы, чтобы обеспечить адекватное разделение отдельных бляшек. Наложение с жидким 10% FBS, содержащим DMEM, содержащее реагенты отбора GPT – микофеноловую кислоту и ксантин при конечных концентрациях 25 мкг/мл и 250 мкг/мл соответственно. После инкубации в 24 часа удалите наложение жидкости и используйте флуоресцентный микроскоп для ищите бляшки, выдающие диффузную красную флуоресценцию, соответствующую включению mCherry из вектора TDS в вирус. В зависимости от гена-мишени и выбранного люминесцентного тега, локализованная флуоресценция помеченного гена также может наблюдаться в том же красном налете. Выберите несколько бляшек для каждого рекомбинантного вируса путем локализованной соскоб с наконечником пипетки и 100 мкл 5% FBS, содержащих DMEM для передачи клеток в трубку Eppendorf, а затем три раунда замораживания оттаивания царапинных клеток для выпуска рекомбинантных вирусов. Добавьте DMEM, содержащий вирус, содержащий лиофилизатор, в монослой клеток в пластине из 12 колодец для усиления рекомбинантных вирусов с реагентами выбора GPT в средствах массовой информации роста. Scrape успешное усиление 24 часов после инфекции. Выполните анализ бляшек успешно усиленных бляшек, экспонирование красной флуоресценции, на этот раз с агарозой наложения и GPT выбор, следующим образом: Семя 6-хорошо пластины с монослой BS-C-1 клеток. Выполните последовательное разбавление рекомбинантных вирусов и заразите скважины все большим разбавлением вирусов в FBS free DMEM. 1 час после заражения, удалить жидкие средства массовой информации и наложить каждый колодец с 0,5% агарозы в минимальной необходимой среде (MEM), содержащий 2,5% FBS, 292 мкг / мл L-глутамин, 100 U/ml пенициллин и 100 мкг / мл стрептомицин, наряду с GPT отбора реагентов. 2-3 дней после заражения, выбрать бляшки отображения флуоресценции, которая является одновременно красным и цвет выбранного флуоресцентного тега, чтобы усилить снова, на этот раз без выбора GPT. Выполните следующий анализ доска с агарозой наложения без выбора. Выберите бляшки, которые потеряли диффузную красную флуоресценцию, но сохраняют локализованную флуоресценцию, соответствующую тегу выбора. Продолжить очистку бляшек без выбора, чтобы получить чистый запас рекомбинантных вирусов, которые потеряли mCherry и gpt отбора генов, но сохранить локализованные флуоресценции, соответствующие выбранной метки. Проверить запасы являются чистыми по налету анализа, все бляшки должны иметь аналогичные фенотипа доска. Используйте ПЦР скрининг геномной ДНК для обеспечения того, чтобы вирусные запасы были чистыми. Дизайн грунтовки, что фланг флуоресцентных генов вставки сайта и грунтовки, которые усиливают вставленный флуоресцентный ген себя. Различные комбинации этих грунтовок будут производить ПЦР ампликонов, которые будут обнаруживать вставки генов и указывать на чистоту. Увеличь вирусные запасы, чтобы быть PCR скрининг в одном колодец 12-хорошо пластины монослой BS-C-1 клеток. 24 часа после инфекции, соскребать инфицированные клетки в 250 мкл DMEM. Центрифуга инфицированных клеток (18000 х г в течение 10 мин, 4 кк), удалить супернатант и повторного деления клеток гранулы в 500 хл TE (10 мМ Tris-HCl и 1 мМ EDTA, рН 8) с 0,1% (V / V) SDS. Вихрь для лиза клеток. Добавьте 500 йл фенол-хлороформ-изоамил акохол, инвертировать, чтобы смешать. Центрифуга (18 000 г в течение 4 мин, 4 градусов по Цельсию). Возьмите супернатант и повторите. Выполните этанол осадков на супернатант, добавив 1 мл 100% этанола (охлажденный) и 50 мкл ацетата натрия, инвертировать для смешивания. Оставьте на ночь при -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию в течение 1 часа. Центрифуга (18 000 х г в течение 30 мин, 4 градусов по Цельсию), удалить всю жидкость и позволить осажденной ДНК высохнуть. Повторное время в 50 хл TE. Используйте это в качестве шаблона для скрининга геномной ДНК ПЦР. 3. Поколение рекомбинантных вирусов, несущих более одного тега Монета подекретит тот же монослой клеток флуоресцентными рекомбинантными вирусами для создания двух- или трех помеченных вирусов или повторной процедуры из Протокола 1) с другим тегом. Очистка вирусов на основе фенотипа бляшек или ПЦР скрининга вирусной изолят геномной ДНК.

Representative Results

На рисунке 1 перечислены различные конструкции, необходимые для этой процедуры, которые либо синтезируются(рисунки 1b и 1c), либосоздаются шагамиклонирования (рисунок 1d). На рисунке 2 представлен план экспериментальной процедуры с репрезентативными флуоресцентными изображениями бляшек рекомбинантного ВАКВ A3-GFP, изображенного на каждом этапе процесса отбора. На рисунке 3показаны рекомбинантные вирусы вакцины, выражаюющие белки, помеченные флуоресцентными маркерами, нацеленными на вирусные структурные белки A3 и F13, которые являютсячастью внутреннего ядра вируса 23 и внешнейоболочки 24,соответственно. Показаны наблюдения вирусных бляшек и инфицированных клеток для каждого из созданных рекомбинантных вирусов. Была проверена эффективность гомологичной рекомбинации векторов с геномом ВАКВ, содержащей до 70 б.п. регионов гомологии, результаты которой изображены на рисунке 4. Относительный успех выявления вирусных бляшек, сделанных из рекомбинации с векторами, содержащими 100 bp гомологии был рассуждения за выбор синтезировать 150 bp длиной левой и правой руки гомологии к целевому гену. Рисунок 1. Переходный доминирующий вектор рекомбинации (TDS). а)вектор TDS с маркерами выбора gpt и mCherry. b) Левыеи правые руки гомологии разработаны с определенными местами ограничения между ними и фланговыми руками гомологии. Местами ограничения между левой и правой руками, используемыми в этом методе, были NotI и BamHI, сайт NotI также используется в качестве связующих звена между геном и флуоресцентным тегом. c)Флуоресцентные метки, совместимые с этим методом, окружены соответствующими сайтами ограничений. Некоторые теги используются GFP (зеленый флуоресцентный белок), RFP (красный флуоресцентный белок), Cerulean (улучшение ECFP, циан флуоресцентный белок, по сайту направленногомутагенеза 25) и мини-SOG, флуоресцентный белок инженерии из GFP, который создает продукт, разгадаемый EMна освещение 26. d)шаги по клонированию, участвующие в генерации окончательного вектора рекомбинации TDS. Синтезированный олигонуклеотид, содержащий левое и правое фланговые руки, сначала клонируется в вектор TDS. Это обеспечивает вектор рекомбинации, в который любой тег выбора может быть перешел в и из клонирования в места ограничения включены между левой и правой руки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 2. Описание экспериментальной процедуры по созданию рекомбинантного вируса вакцины. События, происходящие на генетическом и клеточном уровнях изображены, наряду с репрезентативными изображениями доска с изложением шагов после создания A3-GFP помечены флуоресцентные вакцины вируса. (A)Клетки, инфицированные вирусом вакцины, трансфицированы вектором рекомбинации TDS. (B)На этой цифре показан только результат левой рекомбинации, и в примере GFP используется в качестве флуоресцентного тега выбора. Правой рекомбинации приведет к всей плазмиды TDS быть включены в геном аналогичным образом, за исключением тег будет слиты со всем геномом цели в промежуточном этапе, т.е. шаг С. Анализ бляшек проводится на монослойной клетке с рекомбинацией и подвергается отбору GPT. C)Таблички,на которых представлены как красные, так и зеленые флуоресценции, соответствующие выражению mCherry и GFP соответственно, собираются и усиливаются. После удаления выделения, будет потеря красной флуоресценции, соответствующей потере генов gpt и mCherry (D) и бляшек,экспонующих исключительно зеленую флуоресценцию, собираются и усиливаются (E). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 3. Репрезентативные результаты рекомбинации системы TDS. Изображения изображают целые бляшки рекомбинантных VACV, заражающих клетки после 48 часов(a, c, e;масштабная планка 100 мкм), сопровождаемая изображением одной клетки, зараженной соответствующим рекомбинантным вирусом после 8 часов(b, d, f;шкала бар 10 мкм). Для визуализации вирусных частиц были отобраны гены, соответствующие локализованным вирионом белкам. A3 является основным белком вакцины virion (a, b) иF13(c, d) является вирусным протеином конверта. Двойной тегами вирус с флуоресцентно помечены A3 и F13(е , F) также показано. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 4. Количественный анализ эффективности рекомбинации между рекомбинантными векторами и геномом ВАКВ. Монослойные BS-C-1 были заражены ВАКВ и трансфицированы 1 час после заражения тремя векторами рекомбинации, содержащими области гомологии либо 500 bp, 100 bp, или 70 bp к геному VACV. Каждый вектор также содержал кассету TDS, состоящую из генов отбора gpt и mCherry. Клетки были восстановлены 24 часов после заражения и lysed освободить рекомбинантных вирусов формируется. Анализы таблички были выполнены на лизатах клеток с помощью средств отбора GPT, а таблички с флуоресценцией mCherry считались успешными рекомбинантами. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 5. Карта вектора gpt-mCherry TDS, показывающая место многократного клонирования. Вектор был описан ранее22 и векторная карта была создана с помощью карты эквалайзера Plasmid Map v1.9 от Чжан Лаборатория группы (SCU). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Discussion

Этот метод описывает эффективный и модульный протокол для создания рекомбинантных вирусов, которые выражают флуоресцентно помеченные вирусные белки. Метод гарантирует, что единственным изменением вирусного генома является добавление тега или маркера, не оставляя после себя маркеров выбора. Короткая длина руки, необходимая для гомологичной рекомбинации, позволяет ее прямо синтезировать, устраняя несколько трудоемких раундов ПЦР и клонирования, в то время как флуоресценция mCherry и метаболический отбор GPT используются для изоляции вирусных промежуточных рекомбинации. Эти промежуточные могут быть решены, после удаления выбора, к вирусу с помеченным геном или обратно к родительскому типу. Аналогичный метод, включающий использование как флуоресцентных, так иметаболических отбора, был описан ранее 27, хотя метод, используемый в данном исследовании, использует более короткие, синтезированные области гомологии, что позволяет идентифицировать желаемый рекомбинантный вирус путем визуализации флуоресценции помеченного гена интереса. Этот вторичный отбор применим только для пометки высоко выраженных вирусных генов, которые производят достаточную флуоресценцию в анализе бляшек. Кроме того, можно было бы предусмотреть вставку полного выражения кассеты, например флуоресцентный белок под сильным вирусным промоутером. В этом случае левая и правая руки будут определять точку вставки, а не вирусный ген, который будет помечен.

Есть несколько ключевых шагов, которые оказались полезными в ходе экспериментальной процедуры. Описанная выше жидкая накладка в шаге 2.3.3 оказалась решающей для обнаружения и изоляции красных/зеленых флуоресцентных бляшек. Мы считаем, что сочетание реагентов отбора GPT и агарозной накладки сдерживало рост рекомбинантных вирусов и поэтому перешло на жидкую накладку для первого шага усиления вирусов после трансфекции. Важно также, чтобы выбрать флуоресцентные бляшки, показывающие локализованные флуоресценции цвета тега для обогащения и очистки, как промежуточные в результате рекомбинации левой руки может привести к диффузной флуоресценции наблюдается в бляшках, если левая рука также содержит промоутер последовательности. Ген маркера mCherry в векторе TDS также может быть заменен gfp, например,для того чтобы позволить для легкого включения и выбора mCherry как флуоресцентный тег.

Некоторые описанные выше методы несколько отличаются от установленных методов создания рекомбинантного вируса вакцины. Например, МВД вируса, используемого для создания рекомбинантов, как правило, меньше, чем 128, однако использование высших MOIs было достаточно для создания рекомбинантных вакцин вируса с помощью этого метода. Использование реагентов выбора GPT обычно требует предустановки клеток с реагентами выбора18, однако добавление их во время фазы спасения после заражения по-прежнему обеспечивает достаточный выбор желаемых рекомбинантов, особенно из-за наличия флуоресцентного маркера отбора, а также.

Как упоминалось ранее, одним из ограничений этого метода является то, что вторичный шаг отбора флуоресценции опирается на помеченный белок интереса высоко выражены, на уровне, который позволяет его обнаружения глазом в налет анализа. Без этого можно было бы очистить вирусы, которые только выставлены mCherry флуоресценции, из которых по крайней мере 50% будет содержать желаемые рекомбинантные вирусы, которые могут быть определены по молекулярным стратегиям, таким как ПЦР описано в шаге 2.12 выше. Другим ограничением может быть инактивация некоторых белков в результате их маркировки. Флуоресцентный тег может подвергаться мутациям или быть вырезан рекомбинантным вирусом с проходят с течением времени. Поэтому рекомендуется регулярное отбор проб рекомбинантных вирусных запасов с помощью микроскопии и ПЦР. Наконец, может быть ограничение на количество флуоресцентно помеченных белков, которые могут быть включены в один вирус. Одним из аспектов этого является способность визуализировать их все одновременно; учитывая перекрывающийся характер спектра выбросов доступных флуоресцентных тегов, важно тщательно выбирать их для обеспечения минимального спектрального кровотечения через. Кроме того, использование тесно связанных тегов, таких как GFP и Cerulean открывает возможность рекомбинации между ними, в зависимости от их расположения в рекомбинантном геноме.

Модульный характер этого метода позволяет простой замены флуоресцентных тегов на основе совместимости с другими окрашивания и / или теги выбор. Путем excising выбираемых маркеров, метод TDS позволяет для серийного добавления различных флуоресцентных белков или сочетание TDS-метки с TDS-удаления генов для фенотипических анализов29. В качестве примера полезности этого подхода был создан двойной флуоресцентный вирус, который маркирует вирусные ядра и мембрану WV. Исследования изображений с этим вирусом могут быть использованы для изучения движения, морфогенеза и обертывания вируса во время репликации вируса. Пока еще нехарактезированные вакцинные вирусные белки также могут быть помечены и изучены этой техникой.

Вирус Vaccinia широко используется в исследованиях изображений из-за многих характеристик вируса, которые являются благоприятными для живоклеточной микроскопии. Флуоресцентные метки выражаются из вирусного генома, устраняя необходимость трансфекции, что позволяет легко анализировать первичные клетки, полученные от инфицированных животных или непереражаемых клеток. Первоначально, флуоресцентные VACVs были использованы для простогосубклеточного отслеживания движения вируса 30, но более поздние подходы расширили свою полезность, чтобы включить исследования FRET31, FRAP на отдельныхвирусных частиц 32,промоутер репортеров 33, интравитальнойвизуализации 34,и структурные исследования 35-37. Все эти методы могут быть в пределах более легкой и близкой досягаемости в сочетании с этим методом создания рекомбинантных флуоресцентных вирусов.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Австралийским исследовательским советом Федерации Discovery Project грантом #1096623.

Materials

Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 ‘-to-5 ‘ Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B., Isaacs, S. N. . Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus – a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. . 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Tags

Fluorescent Protein TaggingVaccinia VirusRecombinant Virus GenerationHomologous RecombinationTransient Dominant SelectionMetabolic SelectionLive-cell MicroscopyVirus-host Interactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image