Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni
Summary
Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.
Abstract
Per dimostrare la localizzazione superficie cellulare di un recettore transmembrana in neuroni in coltura, abbiamo etichettato la proteina sulla superficie dei neuroni vivi con un anticorpo primario specifico sollevato contro una porzione extracellulare della proteina. Dato che i recettori sono trafficate da e verso la superficie, se le cellule vengono permeabilizzate dopo fissazione quindi sia sulla superficie cellulare e proteine interna verrà rilevato dal medesimo anticorpo secondario marcato. Qui, abbiamo adattato un metodo utilizzato per studiare traffico di proteine ("alimentazione anticorpo") per differenzialmente proteina etichetta che era stato internalizzato per endocitosi in fase di incubazione anticorpo e proteina che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo . La capacità di distinguere queste due piscine di proteine è stato reso possibile attraverso l'incorporazione di un passo di blocco durante la notte con l'anticorpo secondario marcato altamente concentrato, dopo un iniziale incubation di neuroni unpermeabilized con un anticorpo secondario fluorescente marcato. Dopo il blocco, passo, permeabilizzazione dei neuroni consentiti rilevamento della piscina internalizzato con un anticorpo secondario fluorescente marcato con un fluoroforo diverso. Utilizzando questa tecnica siamo riusciti ad ottenere importanti informazioni circa la posizione subcellulare di questo recettore putativo, rivelando che si trattava, infatti, di tratta alla superficie cellulare nei neuroni. Questa tecnica è ampiamente applicabile ad una gamma di tipi di cellule e proteine di superficie cellulare, fornendo un anticorpo adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile.
Introduction
Nello stabilire la funzione delle proteine di nuova identificazione, indagine della localizzazione subcellulare e il traffico della proteina in questione può fornire importanti indizi circa il probabile ruolo / s del 1,2 proteine. L'analisi bioinformatica del trascrittoma della neocorteccia di sviluppo 3 ci ha fornito una lista di geni che presentano espressione alterata durante il mouse corticogenesi cervello. Abbiamo quindi adottato un approccio del gene knockout per accertare che la proteina codificata da uno di questi geni, sez6, ha un ruolo chiave nello sviluppo del neurone. Abbiamo osservato che il gene sequestro legati 6, o Sez6, la proteina si trova a dendriti di sviluppo ed è presente anche nelle spine dendritiche, le strutture specializzate in dendriti che ricevono e integrano segnali eccitatori. Inoltre, quando questa proteina viene a mancare, dendriti e sinapsi eccitatorie non riescono a formare correttamente 4. L'isoforma dominante probabile della proteina ha caratteristiche di un transmembrane recettore anche se, quando la distribuzione subcellulare di proteine immunolabeled stata esaminata mediante microscopia confocale o mediante microscopia immunoelettronica maggior parte, se non tutti, del segnale apparso associato con piccole vescicole nel vano Somatodendritic con poca o nessuna, proteina marcata sulla membrana plasmatica sulla superficie cellulare.
Per dimostrare definitivamente che questo recettore putativo con un grande dominio extracellulare predetto viene trafficata alla membrana plasmatica, abbiamo adottato un approccio live-cell usando l'antisiero avevamo generato ad una porzione extracellulare della proteina di etichettare proteine sulla superficie cellulare. Combinando questo approccio "anticorpo alimentazione" con due applicazioni di anticorpo secondario differenziale marcato separati da un ampio passo di blocco ed una fase di permeabilizzazione, siamo stati in grado di identificare due diverse piscine di proteine distinte legandosi agli anticorpi secondari fluorescenti marcate cuscinetto diverso fltags ENT. Così, siamo stati in grado di distinguere proteina che era stato internalizzato per endocitosi in fase anticorpo incubazione da proteine che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo. Usando questo metodo, abbiamo stabilito che la proteina di interesse viene trafficata da e superficie cellulare nei neuroni. Pertanto, questa tecnica relativamente veloce e semplice dimostrato più informativo rispetto ai metodi tradizionali immunocitochimica o pre-embedding microscopia elettronica immunogold, nonostante il fatto che abbiamo usato lo stesso antisiero policlonale di coniglio per tutte queste tecniche. Questa tecnica è generalmente applicabile a qualsiasi proteina transmembrana fornito una buona anticorpo che riconosce epitopi dominio extracellulare è disponibile. La tecnica è stata utilizzata in precedenza per studiare traffico recettore del recettore glutammato GluR1 subunità 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica qui descritta è complementare a quella di biotinylation superficie cellulare (valutato da Arancibia-Carcamo et al.) 12 ed è il metodo di scelta per conservare informazioni sulla localizzazione subcellulare della proteina internalizzato, disponibile un anticorpo primario adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile. Inoltre, la quantificazione del traffico di proteine / internalizzazione nel tempo può essere eseguita (fissando coprioggetto in momenti diversi durante l'inc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Teele Palumaa per l'assistenza con le figure. Finanziato dal progetto di Grant 1008046 dal National Health and Medical Research Council, Australia.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
Referências
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