Differensial Merking av Cell-overflaten og internalisert Proteiner etter Antistoff Fôring av Levende Cultured Neuroner
Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for å merke proteiner på overflaten av levende neuroner ved å bruke et spesifikt polyklonalt antistoff til ekstracellulære epitoper. Protein bundet av antistoff på celleoverflaten og senere internaliseres via endocytose kan skilles fra protein som gjenstår, eller trafikk til, overflaten i løpet av inkuberingen.
Abstract
For å demonstrere den celleoverflaten lokalisering av et antatt transmembranreseptoren i dyrkede nevroner, merket vi proteinet på overflaten av levende neuroner med en bestemt primær antistoff reist mot en ekstracellulær del av proteinet. Gitt at reseptorer er trafikkert til og fra overflaten, hvis celler er permeabilized etter fiksering og deretter både celle-overflate og interne protein vil bli detektert av den samme merket sekundært antistoff. Her vi tilpasset en metode som brukes for å studere protein handel ("antistoff feeding") for å differensielt etikett protein som var blitt internalisert etter endocytose ved antistoffet inkubasjonstrinn og protein som enten forble på celleoverflaten eller er trafikkert til overflaten i løpet av denne perioden . Evnen til å skille mellom disse to dammer av protein ble gjort mulig ved inkorporering av en over natten blokkering trinn med høyt konsentrert umerket sekundært antistoff etter en innledende inkuberingn av unpermeabilized nevroner med en fluorescently-merket sekundært antistoff. Etter blokkerende trinn, permeabilization av neuronene tillatt påvisning av internalisert basseng med et fluorescerende sekundært antistoff som er merket med en annen fluorofor. Ved hjelp av denne teknikken vi var i stand til å innhente viktig informasjon om den subcellulære plasseringen av denne antatte reseptor, avslører at det var faktisk smugles til celleoverflaten i nevroner. Denne teknikken er bredt anvendelig på en rekke celletyper og celle-overflateprotein, og gir et egnet antistoff til en ekstracellulær epitope er tilgjengelig.
Introduction
I etablere funksjonen av nylig identifiserte proteiner, kan etterforskningen av den subcellulære lokalisering og trafficking av proteinet i spørsmålet gi viktige ledetråder om den sannsynlige rolle / s av protein 1,2. Bioinformatiske analyse av transcriptome av utviklings neocortex 3 gitt oss en liste av gener som viser endret uttrykk under mus hjernen corticogenesis. Vi deretter vedtatt et gen knockout tilnærming for å fastslå at proteinet kodet av en av disse genene, sez6, har en nøkkelrolle i nevroner utvikling. Vi observerte at Seizure-relatert gen 6, eller Sez6, protein ligger i utviklings dendritter og er også til stede i dendrittutløperne, spesialiserte strukturer på dendritter som mottar og integrerer eksitatoriske signaler. Videre, når dette proteinet mangler, dendritter og eksitatoriske synapser mislykkes i å danne fullstendig 4.. Den sannsynlige dominerende isoform av proteinet har funksjonene til et transmembrane reseptoren selv, når den subcellulære fordeling av immunolabeled protein ble undersøkt ved konfokal mikroskopi eller ved immunoelectron mikros de fleste, om ikke alle, av signalet først forbundet med små blærer i somatodendritic rommet med liten, eller ingen, protein merket på plasmamembranen på celleoverflaten.
For definitivt å vise at denne antatte reseptor med en forutsagt stort ekstracellulært domene er trafikkert til plasmamembranen, vi innført en levende celle tilnærming ved hjelp av antiserum som vi hadde generert til en ekstracellulær del av proteinet til å merke proteiner på celleoverflaten. Ved å kombinere denne "antistoff fôring" tilnærming med to anvendelser av forskjellig-merket sekundært antistoff adskilt av en omfattende blokkering trinn og en permeabilization skritt, var vi i stand til å identifisere to ulike bassenger av protein preget av binding til fluorescently-merket sekundære antistoffer peiling forskjellige fluorescerendeent koder. Således, var vi i stand til å skille protein som var blitt internalisert etter endocytose ved antistoffet inkubasjonstrinn fra protein som enten forble på celleoverflaten eller er trafikkert til overflaten i løpet av denne perioden. Ved hjelp av denne fremgangsmåte ble det etablert at proteinet av interesse er trafikkert til og fra celleoverflaten i nerveceller. Derfor denne relativt rask og enkel teknikk vist seg mer informativ enn tradisjonelle immunocytokjemi metoder eller pre-embedding immunogold elektronmikroskopi, til tross for at vi brukte samme kanin polyklonale antiserum for alle disse teknikkene. Denne teknikk er anvendbar generelt for enhver transmembran protein ga en god antistoff gjenkjenne ekstracellulære domene epitoper er tilgjengelig. Teknikken har blitt brukt tidligere for å studere reseptor smugling av glutamat reseptor GluR1 subenhet fem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikken som beskrives her er komplementær til den av celle-overflate biotinylering (gjennomgått av Arancibia-Carcamo et al.) 12 og det er den foretrukne metode for å bevare informasjon om de subcellulære lokalisering av internalisert protein, forutsatt at et egnet primært antistoff til en ekstracellulære epitop er tilgjengelig. I tillegg kan kvantifisering av protein handel / internalisering over tid utføres (ved å feste dekkglass på forskjellige tidspunkter i løpet av levende celle inkub…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Teele Palumaa for å få hjelp med tallene. Finansiert av Project Grant 1008046 fra National Health and Medical Research Council, Australia.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
Referências
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
