Differential Mærkning af Celle-overflade og internaliseres Proteiner efter Antibody Fodring Live dyrkede neuroner
Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til at mærke proteiner på overfladen af levende neuroner under anvendelse af et specifikt polyklonalt antistof mod ekstracellulære epitoper. Protein bundet af antistof på celleoverfladen og derefter internaliseres via endocytose kan skelnes fra protein forbliver på eller handles til overfladen under inkubationen.
Abstract
For at påvise celleoverfladen lokalisering af en formodet transmembran-receptor i dyrkede neuroner, vi mærkede protein på overfladen af levende neuroner med en specifik primær antistof rejst mod en ekstracellulær del af proteinet. Eftersom receptorer bliver solgt til og fra overfladen, hvis cellerne permeabiliseret efter fiksering derefter både celle-overflade og indre protein vil blive detekteret af den samme mærket sekundært antistof. Her har vi tilpasset en metode, der anvendes til at studere protein-handel ("antistof fodring"), differentielt etiket-protein, der var blevet internaliseret ved endocytose i antistoffet inkubationstrin og protein, der enten forblev på celleoverfladen eller var handles til overfladen i løbet af denne periode . Evnen til at skelne mellem disse to puljer af protein blev muliggjort gennem inkorporering af en overnatning blokering skridt med højt koncentrerede umærket sekundært antistof efter en indledende incubation af unpermeabilized neuroner med en fluorescens-mærket sekundært antistof. Efter blokering trin permeabilisering af neuroner tilladt påvisning af internaliseret pool med en fluorescerende sekundært antistof mærket med en anden fluorofor. Ved at bruge denne teknik, som vi var i stand til at indhente vigtige oplysninger om den subcellulære placering af denne formodede receptor, der afslører, at det var faktisk handles til celleoverfladen i neuroner. Denne teknik er bredt anvendelig til en række celletyper og celleoverfladeproteiner, der giver en egnet antistof mod en extracellulær epitop er tilgængelig.
Introduction
Ved at etablere funktionen på nyligt identificerede proteiner, kan undersøgelse af subcellulære lokalisering og handel af proteinet pågældende give vigtige fingerpeg om sandsynlige rolle / s af proteinet 1,2. Bioinformatisk analyse af transkriptomet i udviklingslandene neocortex 3 forsynet os med en liste over gener udviser ændret udtryk i løbet af mus hjerne corticogenesis. Vi vedtog derefter et gen knockout tilgang til at konstatere, at proteinet kodet af et af disse gener, sez6, har en central rolle i neuron udvikling. Vi observerede, at beslaglæggelsen-relateret gen 6 eller Sez6, protein ligger i udviklingslandene dendritter og er også til stede i dendritiske Torner, specialiserede strukturer på dendritter, der modtager og integrerer excitatory signaler. Desuden, når dette protein mangler, dendritter og excitatoriske synapser undlader at danne korrekt 4. Den sandsynlige dominerende isoform af proteinet har funktioner i en transmembrane receptoren selv, når den subcellulære fordeling af immunmærket protein blev undersøgt ved konfokal mikroskopi eller ved immunoelektronmikroskopi de fleste, hvis ikke alle, af signalet banke forbundet med små blærer i somatodendritisk rum med lidt eller slet ingen, protein mærkes på plasmamembranen på celleoverfladen.
For endeligt at vise, at denne formodede receptor med et forventet stort ekstracellulært domæne handles til plasmamembranen vi vedtaget en levende-celle-fremgangsmåde under anvendelse af antiserum vi havde genereret til en ekstracellulær del af proteinet til at mærke proteiner på celleoverfladen. Ved at kombinere dette "antistof fodring" tilgang med to anvendelser af differentielt mærket sekundært antistof adskilt af en omfattende blokering skridt og et permeabilization skridt, var vi i stand til at identificere to forskellige puljer af protein kendetegnet ved binding til fluorescens-mærkede sekundære antistoffer bærer forskellige fluorescerENT tags. Således var vi i stand til at skelne protein, der var blevet internaliseret ved endocytose i antistoffet inkubationstrin fra protein, der enten forblev på celleoverfladen eller var handles til overfladen i løbet af denne periode. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, har vi konstateret, at proteinet af interesse handles til og fra celleoverfladen i neuroner. Derfor er dette relativt hurtig og enkel teknik vist sig mere informativ end traditionelle immuncytokemi metoder eller præ-indlejring immunguld elektronmikroskopi, trods det faktum, at vi brugt den samme kanin polyklonalt antiserum for alle disse teknikker. Denne teknik er alment gældende for enhver transmembrane protein gav en god antistof, som genkender ekstracellulære domæne epitoper er til rådighed. Teknikken har tidligere været anvendt til at studere receptor handel glutamatreceptoren GluR1 underenhed 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne teknik er komplementær til celleoverflade-biotinylering (gennemgået af Arancibia-Carcamo et al.) 12, og det er den foretrukne metode til at bevare information om den subcellulære lokalisering af det internaliserede protein, forudsat at en passende primære antistof til et extracellulær epitop er tilgængelig. Desuden kan kvantificering af protein handel / internalisering tiden udføres (ved fastsættelse af dækglas på forskellige tidspunkter i løbet af levende celler inkubati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Teele Palumaa for assistance med tallene. Finansieret af Project Grant 1008046 fra National Health og Medical Research Council, Australien.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
Referências
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
