Summary

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Published: February 12, 2014
doi:

Summary

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Abstract

Kültüre edilmiş nöronlarda bir farazi transmembran reseptörünün hücre yüzeyi yerini göstermek amacıyla, protein, bir hücre dışı bölümüne karşı ortaya çıkartılan bir antikor ile belirli bir primer, canlı nöronların yüzeyi üzerinde protein etiketli. Hücreler daha sonra tespit sonrası hücre yüzeyi ve iç protein her ikisi de aynı etiketli ikincil antikor ile tespit edilecek ise geçirgen reseptör olarak, yüzeye ve kaçırılan olduğu göz önüne alındığında. Burada, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş antikor, inkübasyon kademesi sırasında ve protein endositoz tarafından internalize edilmiş etiket protein diferansiyel protein kaçakçılığı ("antikor besleme") çalışma için kullanılan bir yöntem adapte . Bu iki protein havuzları ayırt etmek yeteneği bir ilk Kuluçka sonra yüksek derecede konsantre edilmiş, etiketlenmemiş ikincil antikor ile bir gece boyunca bloke aşamasının dahil edilmesi sayesinde mümkün olmuştur, flüoresan-işaretli sekonder antikor ile unpermeabilized nöronların n. Farklı bir florofor ile işaretlenmiş bir fluorescent sekonder antikor ile içsel havuz tespit izin nöron bloke edici aşama, sonra, nüfuziyet. Biz ne olduğunu ortaya koyan, bu farazi reseptörün hücre içi konumu hakkında önemli bilgiler elde başardık bu tekniği kullanarak, gerçekten, nöronlarda hücre yüzeyine ticaretine. Bu teknik, bir hücre-dışı epitopuna uygun bir antikorun sağlanması ve kullanılması, hücre tipleri ve hücre yüzey proteinleri bir dizi geniş çapta uygulanabilir kullanılabilir.

Introduction

Yeni tanımlanan proteinin işlevini kurulması, söz konusu proteinin hücre içi lokalizasyonu ve ticareti araştırılması protein 1,2 olası rolü / s ile ilgili önemli ipuçları sağlayabilir. Gelişmekte neokorteks 3 transcriptome biyoinformatik analizi fare beyin Kortikogenezin sırasında değişmiş ifadesini sergileyen genlerin bir listesini bize sağladı. Daha sonra, bu genlerin, sez6 tarafından kodlanan protein, nöron gelişmesinde önemli bir role sahip olduğunu tespit etmek için bir gen nakavt bir yaklaşım kabul etmiştir. Biz Nöbet-ilişkili gen 6 veya Sez6, protein gelişmekte dendritler bulunan ve aynı zamanda dendritik dikenler, almak ve uyarıcı sinyalleri entegre dendritler özelleşmiş yapılar mevcut olduğu görülmektedir. Bu proteinin eksik olduğunda Dahası, dendritler ve uyarıcı sinapsların doğru 4 oluşturmak için başarısız. Proteinin olası hakim izoformu transmembran bölgesinin özelliklere sahiptire imüno-reseptör proteininin hücre içi dağılımı konfokal mikroskopi ile ya da imünoelektron mikroskopla incelenmiş zaman, her ne kadar çoğu, hepsi değilse de, sinyalin plazma zarının etiketli çok az ya da hiç protein ile somatodendritik bölmesindeki küçük veziküller ile ilişkili ortaya Hücre yüzeyinde.

Kesin bir tahmin büyük bir hücre-dışı etki alanı ile farazi reseptör plazma zarına kaçırılan olduğunu göstermek için, biz, hücre yüzeyinde proteini etiketlemek için proteinin bir hücre dışı kısmına oluşturulan olan antiserum kullanarak canlı hücre bir yaklaşım kabul etmiştir. Geniş bir bloke etme ve bir permeabilizasyon adım ayrılmış diferansiyel etiketli ikincil antikor, iki uygulama ile, bu "antikor besleme" yaklaşımı birleştirerek, floresan-etiketli sekonder antikorları farklı fluoresc taşıyan bağlanarak ayırt proteininin iki farklı havuzları tespit etmişlerdirKBB etiketleri. Böylece, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş proteinden antikor inkübasyon aşaması esnasında endositoz tarafından internalize edilmiş bir protein ayırt etmek mümkün oldu. Bu yöntemi kullanarak, ilgi konusu olan protein nöronlarda hücre yüzeyine ve kaçırılan olduğunu kurulmuştur. Bu nedenle, bu nispeten hızlı ve basit bir teknik tüm bu teknikler için aynı tavşan poliklonal antiserumu kullanılan gerçeğine rağmen, geleneksel yöntemlerle immünositokimya ya da önceden gömme immünolojik elektron mikroskobu daha fazla bilgi kanıtladı. Bu teknik, hücre dışı alanı epitopları tanıyan iyi bir antikor kullanılabilir verilen herhangi bir transmembran proteinin genel olarak uygulanabilir. Bu teknik, glutamat reseptör alt-biriminin GluR1 5 reseptör kaçakçılığı incelemek için daha önce kullanılmıştır.

Protocol

1.. Disosiye Hipokampal Nöron Kültürü Lamelleri (borosilikat cam) hazırlayın: % 100 etanol içinde yıkayın. UV ışınlaması altında hava kuru. Poly-D-lisin (gece boyunca 4 ° C 'de, 0.15 M borat tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile kaplayın. Bir sonraki gün (kültürün gün) laminin ile daha sonra kat PBS içinde 3 kez yıkayın üzerinde (2.5 ug / ml, doğal fare laminin) +% 5 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 saat de PBS iç…

Representative Results

Burada sunulan iki renkli floresan immüno-lekeleme tekniği (Şekil 1 'de şematik olarak gösterildiği gibi) canlı hücrelerde transmembran proteinlerin hücre dışı etki etiketleme için yararlıdır. Kuluçka süresi boyunca, immünoglobulinler, erişilebilir epitopları bağlanan ve birlikte bağlı antikor ile protein moleküllerinin popülasyonunun bir kısmı, endocytosed edilir. Buna ek olarak, yeni sentezlenen protein ileri ticareti vasıtasıyla hücre yüzeyine ulaşabilir ve geri ka…

Discussion

Burada anlatılan teknik, (by-Cárcamo Arancibia et al. Yorumlanan), hücre-yüzeyi biyotinilasyon 12 ile tamamlayıcı olan ve bu içsel proteininin hücre-altı lokalizasyonu hakkında bilgi muhafaza etmek için tercih edilen bir yöntem, uygun bir birincil antikor bir sağlanan hücre epitopu kullanılabilir. Buna ek olarak, zaman içinde protein ticareti / içselleştirme kantitasyonu protein özleri hazırlamak üzere gerek kalmadan (birincil antikor ile canlı hücre inkübasyonu boyunca farkl?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar rakamları ile yardım için Teele Palumaa teşekkür ederim. Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Proje Grant 1008046 tarafından finanse edilmektedir.

Materials

PBS with Ca and Mg Invitrogen 14040182
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B27 supplement Invitrogen 17504-044
L-glutamine Invitrogen 25030-081
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation PDS
Bovine Serum Albumin  Sigma Aldrich Australia A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red Invitrogen (Gibco) 14175-079
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich Australia P0899
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015 Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone Thermo Fisher
fluorodeoxyuridine Sigma Aldrich Australia F0503
uridine Sigma Aldrich Australia U3003
18 mm round glass coverslips Menzel Gläser CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium Vector Laboratories H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649  Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-007-003
Paraformaldehyde Sigma Aldrich Australia P6148 TOXIC – handle in fume hood
Triton-X-100 Sigma Aldrich Australia T8787
Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody Invitrogen – Molecular Probes A21206

Referências

  1. Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
  2. von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
  4. Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
  5. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
  6. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  7. Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
  8. Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
  9. Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
  10. Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
  11. Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
  12. Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
  13. Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
  14. Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).

Play Video

Citar este artigo
Carrodus, N. L., Teng, K. S., Munro, K. M., Kennedy, M. J., Gunnersen, J. M. Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons. J. Vis. Exp. (84), e51139, doi:10.3791/51139 (2014).

View Video