Den etablerte teknikken for å vaksinere primære invasive ortotopiske blærekreft xenografts krever laparotomi og mobilisering av blæren. Denne prosedyren påfører betydelig sykelighet på mus, er teknisk utfordrende og tidkrevende. Vi har derfor utviklet en høy presisjon, perkutan tilnærming benytte ultralyd veiledning.
Ortotopiske blærekreft xenografts er gullstandarden for å studere molekylære cellulære manipulasjoner og nye terapeutiske agenter i vivo. Egnede cellelinjer er inokulert enten ved intravesikal instillasjon (modell av nonmuscle invasiv vekst) eller utført injeksjon i blæreveggen (modell av invasive vekst). Begge fremgangsmåter er komplekse og svært tidkrevende. I tillegg har overflatemodell sine mangler på grunn av mangel på cellelinjer som er tumorigen følgende instillasjon. Intramural injeksjon, på den annen side, blir skjemmet av invasivitet av fremgangsmåten og den tilhørende sykelighet for verten mus.
Med disse svakhetene i tankene, vi endret tidligere metoder for å utvikle en minimal invasiv tilnærming for å skape ortotopiske blærekreft xenografts. Ved hjelp av ultralyd veiledning har vi vellykket utført perkutan inokulering av blærekreft cellelinjer UM-UC1, UM-UC3 og UM-UC13 inn 50 atymisk naken. Vi har vært i stand til å vise at denne tilnærmingen er tidseffektiv, presis og trygg. Med denne teknikken, er i utgangspunktet et mellomrom opprettet under blæren mucosa med PBS, og tumorceller blir deretter sprøytet inn i dette rommet i et andre trinn. Tumorvekst overvåkes regelmessig med Bioluminescens bildebehandling og ultralyd. De gjennomsnittlige tumorvolum økt jevnt i alle unntatt én av våre 50 mus i løpet av perioden.
I vår institusjon, denne romanen tilnærming, noe som gjør at blærekreft xenograft vaksinering i et minimalt-invasiv, rask og svært presis måte, har erstattet den tradisjonelle modellen.
Cancer forskning er avhengig av dyremodeller av human cancer med bruk av cellelinjer avledet fra pasientens tumor for å utdype vår forståelse av tumorbiologi. For in vivo vekstanalyse under ulike behandlingsstrategier murine ortotopiske blærekreft modeller forbli referansen standard 1,2. Vaksinasjonen av menneskelige blære kreft celler hos immunsupprimerte mus (xenograft modell) avhengig av intravesikal instillasjon ("intravesikal modellen") 3,4,5 eller direkte injeksjon i blæreveggen ("egenutført modellen") 6,7. Begge teknikkene kan også utføres i rotter 8,9.
Intravesikal instillasjon induserer dannelsen av tumorer på uroteliale overflate av blæren som deretter er mottakelig for etterfølgende intravesikal instillasjon av nye behandlingsmidler. Imidlertid er antallet av cellelinjer som er pålitelig tumorigen når levert via denne metoden begrenset end en av disse cellelinjer, KU7, har nylig blitt vist å være HeLa 4,10. Intravesikal instillasjon også er tidkrevende på grunn av nødvendige holdetider, og det ofte induserer tumorvekst i naboelementer i urinveiene, inkludert urinrør, urinleder, og nyrebekken 11.. Videre fører intravesikal instillasjon ofte til tumorvekst på gulvet av blæren, hvor urinlederne går inn i blæren, og dette kan føre til overveier obstruksjon og samtidig nyresvikt.
Primære blærekreft xenografter som er egnet for systemisk behandling er laget ved direkte injeksjon av tumorceller inn i blæreveggen 12.. Selv om tallrike cellelinjene vokser tilstrekkelig i denne modellen, er ikke begrenset til dens invasivitet av modellen i forbindelse med behovet for en abdominal innsnitt 13.. Modellen er også utfordrende å lære på grunn av tekniske problemer av å injisere celler presist inn i muskelen veggenav blæren.
En ny tilnærming til å etablere ortotopiske primære blærekreft xenografts i mus har blitt utviklet i vår avdeling for å ivareta eksisterende mangler av "egenutført modellen". Vi var i stand til å optimalisere perkutan, ultralyd-styrt injeksjon av blærecancerceller inn i det fremre blæreveggen og dermed en ny teknikk for å erstatte den etablerte invasiv modell. Videre har vi potensielt forbedret nøyaktighet og reproduserbarhet av "utført modellen".
Nesten alle store fremskritt innen kreftbehandlingen vil kreve testing i dyremodeller før oppstart av kliniske studier. Dyremodeller av kreft er viktige verktøy som gjør forskerne å studere tumorbiologi in vivo. Ortotopiske xenograft modeller fortsatt gullstandarden 1,2 og fortsette å tilby den mest fleksibilitet (i form av valg av cellelinjer) og har mest praktisk nytte.
Den illustrerte fremgangsmåten er en minimal invasiv modifikasjon av orthotopic modell som tidligere beskrevet av Dinney et al. 12. Vi etablerte xenograft tumorer ved ultralyd styrt perkutan injeksjon av tre forskjellige cellelinjer med et teknisk suksessrate på 100%. Under kontinuerlig oppfølging, viste 98% av mus konstant økning i tumorvolum.
Ved å utføre et minimalt-invasiv teknikk var vi i stand til å løse eksisterende begrensninger av egenutført modell. Foruten respecting dyrevelferd, redusert invasivitet av dette bidrar også til reproduserbarhet av in vivo eksperimenter ved å redusere antall kirurgiske komplikasjoner. Det er svært tidsbesparende å unngå en abdominal laparotomi og tilhørende behov for lukking av sår. Vi var i stand til å redusere i betydelig grad den prosedyre tid per dyr til 3,4 min (± 1,6). Imidlertid er den viktigste fordelen med vår ny tilnærming dens nøyaktighet. Høyoppløselig ultralyd tillater oss å visualisere plass opprettet av saltvann injeksjon under slimhinnen i blæreveggen. Dette første trinnet injeksjon forenkler svulst celle injeksjon i et andre trinn, og minimerer risikoen for tumorcelle søl. Dette står i kontrast til den teknikken for egenutført injeksjon etter laparotomi, der det er umulig å visualisere nål plassering, og det er alltid et element av usikkerhet med hensyn til nøyaktig dybde av injeksjon. Også, som vi inokulere tumorceller strengt i den fremre blæreveggen, tumor growtt på den bakre blæreveggen unngås. Deretter hastigheten av hindrende komplikasjoner på grunn av tumorvekst i nærhet av urinleder munninger er meget sjeldne. Dette medfølgende effekt tillater lengre vekst og behandlingsperioder.
Den viktigste begrensning av ultralyd-styrt svulst inokulering er behovet for tilfredsstillende teknisk utstyr. Derfor resultatene av denne prosedyren vil trolig være begrenset til sentrene som er spesialisert i dyremodeller av menneskelig kreft. Dette bør oppmuntre samarbeid mellom forskningsgrupper utenfor disse institusjonene og de konsern med ekspertise i en slik roman dyr modell.
Selv avhengig av kjennskap til ultralydavbildning og noen fingerferdighet, er denne modellen lett å lære etter kompetent instruksjon. Nøkkelen trinn i prosedyren er etableringen av en kunstig plass submucosally i blæreveggen med saltvann. Når denne plassen er opprettet uten perforering of slimhinnelaget, forblir den stabil i flere minutter. Den veiledning av den andre nål inn i dette mellomrom for å inokulere tumorcellene er relativt enkel. Den viktigste komplikasjon under opprettelsen av submukøst plass er perforering av nålen inn i blæren lumen. Opprettelsen av en submukøst plass, men er fortsatt mulig. Nålen har til å bli trukket langsomt inn i blæreveggen og saltvann injisert bare når slimhinnen vendes over tuppen av nålen. Etter denne manøveren den submucosal mellomrom er mindre stabile (saltvann vil unnslippe til blæren lumen innen 30-60 sekunder) og injeksjon av tumorcellene har til å bli utført raskt. Søl av tumorceller inn i blæren lumen kan forekomme i slike tilfeller med perforering av mucosa. Selv om tapet av kreftceller fra egenutført plass kan føre til en redusert tumor volum under oppfølging, har vi aldri observert noen intravesikal svulst opptak.
En annen potensiell complication er utslippet av tumorceller i bukhulen gjennom injeksjonskanalen. Vi observerte bare en intraperitoneal svulst celle spredning i 50 dyr, og dette skjedde i en av våre første forsøk. Vi tilskriver dette til injeksjon av en for stor tumorcellesuspensjon volum. Dette ble støttet av det faktum at det å redusere volumet 50-40 pl resulterte i ingen ytterligere intraperitoneal søl.
Denne minimalt invasive inokulering av murine orthotopic blærekreft xenograft representerer en innovativ endring av eksisterende "egenutført modellen", fordeler både etterforsker og dyrene likt. Fordelene med denne modellen og stimulere en tilpasning til andre organer slik som nyre, prostata og leveren for å etablere ortotopiske xenograft tumorer i et minimalt-invasiv måte.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Eliana Beraldi for å utføre viral transduksjon av tumorcellelinjer og Ben Deeley for sin instruksjon om bruk av små dyr ultralydavbildning plattform.
Dette prosjektet ble støttet av den tyske stiftelsen System (DFG, JA 2117/1-1: 1), den kanadiske Cancer Society Research Institute og en mentor Lege Scientist Award fra Vancouver Coastal Health Research Institute. Den ultralydavbildning plattformen ble finansiert av den kanadiske Foundation for innovasjon.
Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
IVIS Lumina III | Caliper Life Science |