Den etablerede teknik til at pode primære invasive ortotopisk blærekræft implanteret kræver laparotomi og mobilisering af blæren. Denne procedure påfører betydelig sygelighed på musene, er teknisk udfordrende og tidskrævende. Vi har derfor udviklet en høj-præcision, perkutan fremgangsmåde udnytter ultralyd vejledning.
Ortotopisk blærekræft xenotransplantater er guldstandarden for at studere molekylære cellulære manipulationer og nye terapeutiske midler in vivo. Egnede cellelinjer podes enten ved intravesikal instillation (model af nonmuscle invasiv vækst) eller intramuralt injektion i blærevæggen (model for invasiv vækst). Begge procedurer er komplekse og meget tidskrævende. Derudover overfladiske model har sine mangler på grund af manglen på cellelinjer, der er tumorigene følgende instillation. Intramuralt injektion, på den anden side er skæmmet af invasiv procedure og den tilhørende sygelighed for værten mus.
Med disse mangler i tankerne, vi ændrede tidligere metoder til at udvikle en minimalt invasiv metode til at skabe ortotopisk blærekræft implanteret. Ved hjælp af ultralyd vejledning har vi med succes udført perkutan podning af blærekræft cellelinjer UM-UC1, UM-UC3 og UM-UC13 i 50 atymiske nøgen. Vi har været i stand til at påvise, at denne tilgang er tid effektiv, præcis og sikker. Med denne teknik, er i første omgang et rum skabt under blæren slimhinde med PBS, og tumorceller injiceres derefter ind i dette rum i et andet trin. Tumorvækst overvåges med jævne mellemrum med bioluminescence billedbehandling og ultralyd. De gennemsnitlige tumor steg støt i på alle, men en af vores 50 mus end den undersøgte periode.
I vores institution, denne nye fremgangsmåde, som giver blærekræft xenograft podning i en minimalt invasiv, hurtig og meget præcis måde, har erstattet den traditionelle model.
Kræftforskning er afhængig af dyremodeller af kræft hos mennesker ved hjælp af cellelinier afledt fra patientens tumorer med henblik på at uddybe vores forståelse af tumor biologi. For in vivo vækstanalyse under forskellige behandlingsstrategier murine ortotopisk blærekræft modeller forblive reference standard 1,2. Podning af humane blære cancerceller i immunkompromitterede mus (xenotransplantatmodel) afhængig intravesikal ("intravesikal model"), 3,4,5 eller direkte injektion i blærevæggen ("intramuralt model"), 6,7. Begge metoder kan også udføres på rotter 8,9.
Intravesikal instillation inducerer dannelsen af tumorer på urothelial overflade af blæren, som derefter er modtagelig for efterfølgende intravesikal instillation af nye behandlingsmidler. Imidlertid er antallet af cellelinier, som er pålideligt tumorigene, når den leveres via denne metode begrænset end en af disse cellelinjer, KU7, er for nylig blevet påvist at være HeLa 4,10. Intravesikal instillation er også tidskrævende som følge af nødvendige opholdstider, og det ofte inducerer tumorvækst i tilstødende elementer i urinvejene, herunder urinrøret, ureter, og renal bækken 11. Endvidere intravesikal ofte fører til tumorvækst på gulvet i blæren, hvor urinlederne ind i blæren, og dette kan forårsage øvre obstruktion og samtidig nyresvigt.
Primære invasive blærekræft xenotransplantater, der er egnede til systemiske behandlinger er skabt ved direkte injektion af tumorceller i blærevæggen 12. Selvom mange cellelinjer vokser tilstrækkeligt i denne model, dens begrænsning er invasiv modellen relateret til behovet for en abdominal incision 13. Modellen er også udfordrende at lære på grund af tekniske vanskeligheder af intravenøs celler præcist ind i musklen væggenaf blæren.
En ny tilgang til at etablere ortotopisk primære invasive blærekræft implanteret i mus er blevet udviklet i vores afdeling med henblik på at afhjælpe eksisterende mangler i "intramurale model". Vi var i stand til at optimere perkutan ultralyd-vejledt injektion af blære cancerceller i den forreste blærevæggen resulterer i denne nye teknik til succes erstatte etablerede invasive model. Desuden har vi potentielt forbedret nøjagtighed og reproducerbarhed af "intramurale model".
Næsten alle store fremskridt i behandlingen af kræft, kræver en afprøvning i dyremodeller inden initiering af kliniske forsøg. Dyremodeller for kræft er vigtige værktøjer, der giver forskerne at studere tumor biologi in vivo. Ortotopisk xenograftmodeller fortsat guldstandarden 1,2 og fortsætte med at tilbyde den mest fleksibilitet (med hensyn til udvælgelse af cellelinier), og har den mest praktiske anvendelighed.
Den illustrerede fremgangsmåde er en minimalt invasiv ændring af orthotopisk model tidligere beskrevet af Dinney et al. 12. Vi har etableret xenotransplantattumorer ved ultralydvejledt perkutan injektion af tre forskellige cellelinjer med en teknisk succesrate på 100%. Under kontinuerlig opfølgning, 98% af musene viste konstant stigning i tumor volumen.
Ved at udføre en minimalt invasiv teknik var vi i stand til at løse de eksisterende begrænsninger i intramurale model. Udover respecting dyrevelfærd, reduceret invasivitet af denne procedure også bidrager til reproducerbarheden af eksperimenter in vivo ved at reducere antallet af kirurgiske komplikationer. Det er meget tid effektivt for at undgå en abdominal laparotomi og tilhørende behov for sårlukning. Vi var i stand til at falde betydeligt proceduren tid pr dyr til 3,4 min (± 1,6). Men den vigtigste fordel ved vores nye tilgang er dens nøjagtighed. Høj opløsning ultralyd gør det muligt at visualisere den plads skabt af saltvand injektion under slimhinden i blærevæggen. Dette første skridt injektion letter tumorcelleinjektion i et andet trin, og minimerer risikoen for tumor celle spild. Dette står i kontrast til en teknik intramuralt injektion efter laparotomi, hvor det er umuligt at visualisere nåleplacering og der er altid et element af usikkerhed om den præcise dybde af injektion. Også, som vi inokulere tumorceller nøje ind i det forreste blærevæggen, tumor growth på den bageste blærevæggen undgås. Efterfølgende hastigheden af obstruktive komplikationer på grund af tumorvækst i nærheden af de ureter åbninger er ekstremt sjældne. Denne ledsagende effekt giver længere vækst og behandlingsperioder.
Den vigtigste begrænsning af ultralyd-vejledt tumorinokulation er behovet for tilstrækkelig teknisk udstyr. Derfor udførelsen af denne procedure vil sandsynligvis være begrænset til centre, der er specialiseret i dyremodeller af kræft hos mennesker. Dette bør tilskynde samarbejde mellem forskergrupper uden for disse institutioner og grupper med ekspertise i en sådan roman dyr modellering.
Selvom afhængig af fortrolighed med ultralydsscanning og nogle håndelag, er let at lære under kompetent instruktion denne model. Det afgørende skridt i proceduren er at skabe et kunstigt rum submukøst i blærevæggen med saltvand. Når dette rum er skabt uden perforering of slimhindelag, forbliver stabil i flere minutter. Vejledning af den anden nål ind i dette rum med henblik på at pode tumorcellerne er relativt simpel. Den vigtigste komplikation under oprettelsen af det submukøse rum er perforering af nålen ind i blæren lumen. Oprettelsen af en submucosal plads, dog stadig lade sig gøre. Nålen skal trækkes langsomt ind i blærevæggen og saltvand injiceret lige når slimhindelaget flips over spidsen af nålen. Efter denne manøvre submukøse rummet er mindre stabil (saltvand vil sive blære lumen inden for 30-60 sek) og injektion af tumorceller skal udføres hurtigt. Spild af tumorceller i blæren lumen kan forekomme i disse tilfælde med perforation af slimhinden. Selvom tabet af tumorceller fra intramurale rum kan føre til en reduceret tumor volumen under opfølgning, har vi aldrig observeret nogen intravesikal tumor optagelse.
En anden potentiel complication er spild af tumorceller til bughulen ved injektion kanal. Vi observerede kun ét intraperitoneal tumor spredning celle i 50 dyr, og det skete i en af vores første forsøg. Vi tilskriver dette til injektion af en for stor tumor cellesuspension volumen. Dette blev understøttet af, at reducere mængden 50-40 ul medførte ingen yderligere intraperitoneal spild.
Dette minimalt invasiv podning af murine ortotopisk blærekræft xenograft repræsenterer en innovativ ændring af den eksisterende "intramurale model", til gavn for både investigator og dyrene ligeligt. Fordelene ved denne model fremme tilpasning til andre organer såsom nyre, prostata og leveren for at etablere ortotopisk xenotransplantattumorer i en minimalt invasiv måde.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Eliana Beraldi til at udføre virustransduktion af tumor cellelinjer og Ben Deeley for hans instruktion om brugen af små dyr ultralydsscanning platform.
Dette projekt blev støttet af den tyske Foundation System (DFG, JA 2117/1-1: 1), den canadiske Cancer Society Research Institute og en mentored Læge Scientist Award fra Vancouver Coastal Health Research Institute. Den ultralydsscanning platform blev finansieret af den canadiske Foundation for Innovation.
Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
IVIS Lumina III | Caliper Life Science |