植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

注：特に断りのない限り、すべてのステップは、室温で行われる。 1。植物材料およびバッファの準備 Nのベンサミ 28時（適切な抗生物質を含むL培地）液体培養中で（200 rpm）を振ることにより、一過性発現（この例では、PRF-FLAG、PRF-3xHA、のPTO FLAG対照として空ベクター）のための目的のアグロバクテリウム·ツメファシエンス株を成長させる定常期までCと°。 収集し、遠心分離（5分間3000×gで）でアグロバクテリウムペレット。上澄み液を捨て、浸透液中でペレットアグロバクテリウムを再懸濁。 600nmの吸光度での光学密度（OD）値（Absを600 nm）を求めることによりアグロバクテリウムの量を測定する。 0.1〜0.8への細菌の外径を調整します。 4週齢のN.潜入ハンによるアグロバクテリウムとのベンサミ植物 （22℃、16時間明）D（1-mlのニードルレス注射器を用いて）、または真空によって（0.02％v / vの界面活性剤を添加）。 注意：最初にほぼ完全に展開された葉を使用し、最も効果的なタンパク質発現のための2すぐに古い葉。ユビキチン化やアセチル化タンパク質の検出のために100 nMのMG-132または100 ng / mlのトリコスタチンAは、それぞれ、1時と2日後に浸潤した葉に浸潤する。 浸潤した葉2〜5日後の浸潤し、液体窒素中で凍結を収穫。 -80℃の冷凍庫でサンプルを格納。 注意：事前に5日間の時間経過にわたってサンプルを採取し、免疫ブロッティングによりタンパク質レベルを検出することで、目的のタンパク質の発現の最高のレベルを決定します。 Aのシロイヌナズナ安定したトランスジェニック系統 A.を育てる6ウェルプレート中のシロイヌナズナ種子を、ウェル当たりの液体MS培地5ml（w / vショ糖1％）を補足した。トランスジェニック系統の5種子（滅菌して成層）に3を入れて観光スポットまたはウェルあたり非形質転換コントロールラインの。成長室にプレートを転送する前に、2日間、200 rpmで振とうすると2週間（22℃、10時間明）に向けて出発。 収穫試料および液体窒素中で凍結。 注：コントロールとして、目的のタンパク質と同じタグで関連のないタンパク質を発現するトランスジェニック系統を使用することができます。 バッファ 1〜2時間緩衝液A脱ガスのバッファを準備します（RLKsのため、他の膜結合タンパク質や核タンパク質は1％v / vのIGEPAL CA-630 53を追加）。 注意：あなたはいつまでも4℃で緩衝液Aを維持することができます。あなたは、トリトンの代わりに、IGEPAL CA-360 V / V 1％を使用することができます。 抽出の前に冷たい緩衝液Bは少なくとも1〜2時間の80ミリリットルを用意します。 注：抽出緩衝液対組織の理想的な比は1:4（w / v）である。 2。タンパク質抽出ただ、抽出前に冷たい緩衝液C​​の80ミリリットルを用意<bR />注意：ユビキチン化タンパク質の検出のために、10μMのMG-132を追加します。 Nの20グラムを挽くベンサミ組織（約15葉）またはA乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でシロイヌナズナ実生（6ウェルプレート当たり2〜4グラム）。 、地上組織20gに冷たい緩衝液C​​の80ミリリットルを追加し、よく混ぜて、氷の上で解凍する。 注：同じ時間（関心と制御のタンパク質）ですべてのサンプルを挽く。 （4℃で予冷）組織ホモジナイザーフルスピードで10秒ずつの3バーストによって均質化する。 4で30分間、30,000×gで22〜25ミクロン組織及び遠心分離機でろ過 ℃、 注：または、新鮮な予冷乳鉢と乳棒で均質化する。 アフィニティーマトリックスのブロッキングおよび洗浄工程のために、バッファD. 20mlのを準備ブロック4で5分間、1％BSAを含有する冷緩衝液Dを500mlを使用して、適切なアフィニティーマトリックスを100ml ℃、 注：優先AFfinity行列は、抗FLAG M2アガロース、ストレプトアビジンアガロース、GFP-Trap_Aおよび抗HAアガロースを含む。 1ミリリットル冷たい緩衝液Dで洗浄3X 氷上の新しいチューブに0.45μmのシリンジフィルターを通して葉エキス、フィルタの上澄みを取り除きます。 注：抽出液の色が緑または黄色である必要があります。サンプルが茶色になっている場合は、破棄して最初からやり直す。 イムノブロットのために粗抽出物のアリコートを取り、5×SDS-PAGEローディング緩衝液を追加し、ボルテックスし、80〜10分間、サンプルを煮沸することにより変性させる ヒートブロックのCを°。 3。タンパク質免疫沈降 2 50ミリリットルチューブにタンパク質抽出物を分割し、各チューブに緩衝液Dに懸濁親和性マトリックスの50μlを加える。 4℃で2時間穏やかに回転させながらインキュベートします注意：インキュベーション時間が長いほど、歩留まりを高めることが見出されていない。 を添加することによって溶出緩衝液の600μlの（親和性マトリックスの6倍ビーズ容量）を調製緩衝液D（最終濃度）：0.5％BSA、（抗FLAG M2アガロース用）0.25 mg / mlのFLAGペプチド、または（ストレプトアビジンアガロース用）10 mMのD-ビオチン。 溶出は、GFP-Trap_Aおよび抗HA行列の場合には推奨されませんので、1×SDS-PAGEローディング緩衝液中で煮沸することに直接進む、ステップ3.11：注意してください。 4℃（千×gで5分）で遠心分離してアフィニティーマトリックスを沈殿させる。 イムノブロットのために結合していない抽出物のアリコートを取り、上澄み液の残りを廃棄し、チューブの底に約500μLを残す。 ワイドボアチップ付きスラリー溶液を再懸濁します。 シングル1.5ミリリットルチューブに両方の管からの混合スラリー溶液を転送します。 今後は、1.5ミリリットルの低タンパク質結合マイクロチューブを使用します。注意して​​ください。 親和性マトリックスを沈殿させ、上澄みを除去するための卓上遠心機を用いて5秒間のパルス3X。 洗浄の間に1ミリリットル冷緩衝Dで3-5Xを洗浄し、親和性matriを沈殿させるX、前述のように、上清を捨てる。最後の洗浄では、注射器の針を用いて過剰の緩衝液Dを削除します。 注：0.1％IGEPALによりバッファDを使用して、最終洗浄は、さらに、非特異的結合を低減するために使用することができる。 振盪しながらその都度、適切な溶出バッファー（抗FLAG M2またはストレプトアビジンアガロースステップ3.2を参照してください）​​3X、5分200μlで溶出する。 単一のチューブ内の3溶出液をプール。吸収性樹脂の30μLを使用してタンパク質を集中。渦は、5分間放置し、樹脂（10,000×gで2分間）沈殿させてみましょう。上清を捨てる。 注意：GFP-Trap_Aおよび抗HAアガロースの場合は、ステップ3.9および3.10をスキップします。 沈殿した親和性マトリックスまたは吸収樹脂に1X SDS-PAGEローディング緩衝液50μlを追加します。 80〜100℃で10分間ボルテックスし、沸騰 ヒートブロックのCを°。 遠心万×gで2分間煮沸アフィニティーマトリックスまたは樹脂。 supernatanの分量5μLイムノブロットのためのT、および約10センチ、SDS-PAGEゲル（ 図2）の上に他の画分で実行されます。 余分な分離が必要な場合は、質量分析によるリン酸化タンパク質の分離および同定のために、（ 図2）〜19センチ、長SDS-PAGEゲル上に残りの45μLをロードします。 注：ブランク、レーンは、サンプルの汚染を低減するために、すべてのサンプルとの間に含めることができる。 4。タンパク消化コロイド状クマシーブリリアントブルー（CCBB）染色でのSDS-PAGEゲルを染色。 注：ケラチンによる汚染を減らすために、ゲルの取り​​扱いを最小限に抑えます。機器やツールのいずれもイムノブロット法や残留タンパク質の混入を残している可能性のある他の活動に使用されていないことを確認してください。 水に大量の洗浄、好ましくはO / Nを有するゲル脱色清潔なかみそりの刃でゲルから目的のバンドをカットします。 注意：イムノブロットを有するゲルを合わせた場合necessa正しい地域を特定するRY。リン酸化は、SDS-PAGEでタンパク質の移動を遅らせることができるように、すぐに目的のバンドの上下の領域をカット。 2〜4ミリメートルの立方体にゲルスライスをDICE（これはゲルがピペットチップをブロックすることなく、チューブ内の溶液でカバーされることを保証する）。チューブ内に配置します。 よく水没ゲルを維持するために必要な容量を見積もります。誘導体化、タンパク質分解酵素およびペプチドの抽出とのインキュベーションのためにこの金額を使用し、洗浄のためのトリプルボリュームに二重を使用しています。 注：標準では、切断されたゲル片を約100μlのダイジェスト洗浄に500μlのソリューションを使用して、脱水のための2×180μL、還元、アルキル化のために120μL、および消化のために120μL、150μL。 （50 mM重炭酸アンモニウム、ABC）で50％アセトニトリルを添加してゲル片を2×20分間（または脱色するまで）を洗浄する。ゲル片を除去しないように注意しながら解決策をオフにピペット。 100％アセトで脱水5分間のニトリルと無料の液体を除去。 注：ゲルが収縮し、白表示されます。青色が解決しない場合は、アセトニトリル/ ABCおよび/または高温（45〜55℃）で長くインキュベートする。 水に10のDTTを追加することによって、タンパク質ジスルフィド結合を還元し、振とうしながら56ºCで30〜45分間インキュベートする。自由な液体を除去する。 20〜30分（室温、暗）のために（50 mMのABC）で55 mMのクロロアセトアミドを添加することによりアルキル化するシステイン残基。自由な液体を除去する。 （50mMのABC）で50％アセトニトリルで洗浄ゲル片を2×10分間。自由な液体を除去する。 5分間、100％アセトニトリルでゲル片を脱水し、自由な液体を除去する。 トリプシン消化のために、使用液（50 mMのABC、平均クマシー染色バンドのための5％アセトニトリル消化緩衝液中のトリプシン100ngの）トリプシンの40μlを加える。ゲル片を10分間再水和することができます。必要に応じて、ゲル片を覆うように消化緩衝液を十分に入れる。 37ºCでインキュベートするO / N 消化を停止し、ゲル片からペプチドを抽出し、5％ギ酸（50％アセトニトリル中）（消化容量と同じ容量を追加する）を追加する。 5〜10分間超音波処理。上清を新しいチューブに移します。抽出3回繰り返します。 凍結乾燥（推奨）または（そのようなスピード-VACまたはサヴァンなど）、真空濃縮装置によりペプチドを乾燥させます。 -20ºCで通販質量分析のためにサンプルを提出してください。 注意：我々は、セインズベリー研究所（ノリッジ、英国）での質量分析施設に当社のサンプルを提出した。質量分析施設のプロトコルはかなり異なるが、典型的には、ペプチドはタンデム質量分析法 – エレクトロスプレーのために結合された液体クロマトグラフィーシステム上にロードする前に、2％アセトニトリル、0.2％トリフルオロ酢酸に溶解する。