تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها.
Abstract
النباتات التكيف بسرعة مع تغير البيئات نظرا لوضع تصور وأنظمة إنذار. خلال الهجوم الممرض والنباتات الاستجابة السريعة للعدوى عن طريق تجنيد وتنشيط مجمعات المناعي. ويرتبط التنشيط في مأمن من المجمعات مع بعض التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات، مثل الفسفرة، ارتباط بالغليكوزيل، أو ubiquitination. وفهم كيفية فشلت هذه PTMs يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم تحقيق المقاومة.
نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لليسين الغنية تكرار ملزمة النوكليوتيدات (NB-LRR) تتفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من التعديلات بعد متعدية الخاصة بهم (PTMs). مع تعديلات صغيرة، وبروتوكول يمكن تطبيقها لتنقية البروتينات النباتية الأخرى المجمعات. ويستند هذا الأسلوب على التعبير عن إصدار الموسومة حاتمة من البروتين من الفائدة، والذي فيما بعد تنقيته جزئيا بذ مناعي وتعرض لمطياف الكتلة لتحديد التفاعل البروتينات وPTMs.
هذا البروتوكول يوضح أن: ط). ويمكن الكشف عن التغيرات الدينامية في PTMs مثل الفسفرة بواسطة مطياف الكتلة؛ الثاني). فمن المهم أن يكون بكميات كافية من البروتين من الفائدة، وهذا يمكن أن تعوض عن عدم وجود نقاء immunoprecipitate؛ الثالث). من أجل الكشف عن PTMs من البروتين من الفائدة، وهذا البروتين لابد من immunoprecipitated للحصول على كمية كافية من البروتين.
Introduction
مسارات المناعي تعتمد على مختلف التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات لتنبيغ بسرعة الإشارات وتنشيط الاستجابات المناعية 1. PTMs هي التعديلات الكيميائية السريعة، وعكسها، ومحددة للغاية من بنية البروتين التي يمكن أن تؤثر على التشكل البروتين، والنشاط، والاستقرار، والترجمة، والبروتين البروتين التفاعلات 2-4. في النباتات، وقد تم تحديد أكثر من 300 أنواع من PTMs بما في ذلك ubiquitination، sumoylation، الكبرتة، ارتباط بالغليكوزيل، والفسفرة 2،5. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة يسلط الضوء على أهمية PTMs في جوانب مختلفة من الحصانة محطة 1،5،6. الفسفرة البروتين، المرفق عكسها من مجموعة الفوسفات إلى سيرين، وبقايا ثريونين أو التيروزين هو منظم من العديد من الوظائف الخلوية وليس من المستغرب أن معظم درس غاية PTM دفاعا النبات يشير شلالات 5-11. التي تعتمد على الفسفرة الإشارات هي جزء لا يتجزأ من defe النباتبدأ تفعيل NSE بعد الإدراك خارج الخلية من الميكروبات عن طريق مستقبلات عبر الغشاء، أو الاعتراف الخلايا من البروتينات المقاومة متعددة المجالات 5،8.
عند غزو النباتات، يتم الكشف عن الميكروبات عن طريق مستقبلات غشاء البلازما تسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 12. خنازير المعروفة هي إما مثل مستقبلات البروتينات (RLPs) أو تحركات مثل مستقبلات (RLKs)، وكلاهما يحمل ectodomain ملزم يجند وعلى مسار واحد عبر الغشاء المجال. وعلى النقيض من RLPs، RLKs ديك مجال الخلايا كيناز 13-15. وectodomain من خنازير بربط الحفظ جزيئات ميكروب يسمى elicitor أنماط المرتبطة الممرض الجزيئية (PAMPs) الرائدة، في حالة RLKs، لautophosphorylation ونقل الفسفوريل ضمن المجال داخل الخلايا 6، 16. المصب التي يسببها تصور الفسفرة من خنازير، الفسفرة اللاحقة للبروتينات حشوية بما في ذلك تحركات 17، </suع> 18، E3 ligases 19،-mitogen تنشيط تحركات البروتينات (MAPKs) 20، 21، تعتمد على الكالسيوم تحركات البروتينات (CDPK) 22، 23، وعوامل النسخ 24 و 25 يؤدي إلى الحصانة أثار PAMP (PTI).
بالإضافة إلى تصور خارج الخلية من قبل خنازير، ويتحقق الاعتراف الخلايا من مسببات الأمراض من خلال مستقبلات حشوية. هذه المقاومة متعددة المجالات (R) البروتينات تحتوي على متغير نطاق N-محطة، مركزية ملزمة النوكليوتيدات (NB) عزر، ويكرر-يسين الغنية C-محطة (LRR)، وبالتالي تسمى البروتينات NB-LRR 26، 27. البروتينات R تعترف مباشر أو غير مباشر جزيئات الفوعة المستمدة من الممرض دعا المستجيبات، والمعروف أيضا لاستهداف خنازير والعقد الأخرى في الجهاز المناعي. الاعتراف يدفع دفاعات قوية مما يؤدي إلى الحصانة أثار المستجيب (ETI) 28-31. البروتينات NB-LRR ديك requisiعزر الشركة المصرية للاتصالات ATP ملزم ضمن المجال NB 30، 32، لكنهم يفتقرون مجال كيناز. وقد تم الإبلاغ عن الفسفرة من المجالات الحفظ من NB-LRRS في مسح البروتين على نطاق واسع 33، ولكن أهميتها لETI غير واضح. على نحو مماثل لPTI، وتفعيل البروتينات NB-LRR يؤدي إلى الفسفرة من البروتينات السيتوبلازمية بما في ذلك MAPKs 34-37 وCDPKs 38-40. الأهم من ذلك، يمكن أن يؤدي إلى الاعتراف المستجيب الفسفرة من البروتينات الإكسسوارات التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات NB-LRR 41. وتشمل بعض الأمثلة RIN4 (نبات الأرابيدوبسيس thaliana) وحديد التسليح (الطماطم، مغد قوطة) البروتينات التي تتفاعل مع البروتينات NB-LRR، RPM1 42 و 43 و 44 الملف Prf، على التوالي. خلال العدوى عن طريق البكتيريا الزائفة syringae، البروتين المستجيب AvrB يدفع RIN4 الفسفرة، وعلى الأرجح من قبل مثل مستقبلات كيناز RIPK 45، <sup> 46. وبالمثل، في الطماطم وP. syringae المستجيبات AvrPto وAvrPtoB لحث الفسفرة من قدرة الإنطلاق 47. وعلى النقيض من RIN4 التي تفتقر مجال كيناز ويجب أن يكون عبر فسفرته، قدرة الإنطلاق هو كيناز نشطة قادرة على صناعة السيارات في الفسفرة 48 وعبر الفسفرة من ركائز 49، 50. في حين يتطلب قدرة الإنطلاق النشاط كيناز من أجل تعتمد على المستجيب بدء الإشارات، المسوخ قدرة الإنطلاق-كيناز القتلى لا تزال قادرة على إشارة على نحو المستجيب مستقلة 51. شرحنا في الآونة الأخيرة هذه الملاحظات من خلال إظهار أن المجمع الملف Prf / جهاز السياحة هو من oligomeric، التي تحتوي على العديد من الجزيئات الملف Prf وقدرة الانطلاق 52 وأن جزيئات جهاز السياحة داخل المجمع نفسه يمكن عبر الفوسفات بعضها البعض 47. اقترحنا نموذج التي جزيء واحد من حديد التسليح (استشعار) تتفاعل مع بروتين المستجيب، مما تسبب في تغير التشكل إلى البروتين NB-LRR (الملف Prf) وهذا بدوره ينشط جزيء قدرة الإنطلاق الثاني (المساعد) الطرافةهين المجمع. في وقت لاحق، والمساعد قدرة الإنطلاق جزيء عبر phosphorylates استشعار قدرة الانطلاق مما يؤدي إلى تنشيط كامل للمقاومة معقدة 47.
وتبين هذه الأمثلة أن تحديد مكونات مجمع المناعي وPTMs إمكاناتهم على الاعتراف المستجيب يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم transduced إشارات من المستجيب تصور لأهداف المصب. نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لNB-LRR-التفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من PTMs بهم. نستخدم نيكوتيانا benthamiana ومجمع الطماطم الملف Prf / جهاز السياحة كنموذج، ولكن يمكن بسهولة أن تطبق نفس البروتوكول لRLKs من N. benthamiana وA. thaliana 53 مع تعديلات صغيرة كما وصفنا في البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن توضيح آلية تنشيط مستقبلات بواسطة PAMPs والمستجيبات تسهم إلى حد كبير في فهمنا للمناعة النبات. في السنوات ال 20 الماضية، كانت الشاشتين الهجين الوراثية والخميرة مفيدة لاكتشاف خنازير والبروتينات NB-LRR. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت البروتوكولات المستندة إلى مطياف الكتلة لتحديد البروتينات تنظم بشكل مختلف خلال المناعي إشارة 55-58، PTMs بهم 11،33،59،60، وتكوين المركبات المناعية 61 والمستجيب يستهدف 62. نحن هنا وصف بروتوكول واضحة لتحديد PTMs تنظيم تفعيل المجمعات المناعي.
بالمقارنة مع البروتوكولات التي سبق وصفها، وهذا البروتوكول يسمح تحديد مفصل للتغيرات الديناميكية للPTMs. يمكن بروتوكولات النهج البروتينات واسعة النطاق تحديد PTMs من البروتينات ولكن ليست قادرة على الكشف عن اللدونة موقع PTMs بسبب الحدتبلغ إد من البروتين. في حالة البروتين الفسفرة، والنهج البروتينات على نطاق واسع عادة فقط تحديد المواقع الفسفرة السائد 11،33،59. توصيف مفصل للوضع البروتين الفسفرة يتطلب كمية كبيرة من البروتين التي يمكن الحصول عليها إلا من خلال تنقية جزئية من البروتين المستهدف 47. وصف بروتوكول هنا الأزواج نهج تنقية البروتين الذي ينتج كمية كبيرة من البروتين الهدف، مع تحليل الطيف الكتلي من البروتين النقي. بعد هذا البروتوكول، ويعزى هذا الحدث الفسفرة واحد من قدرة الإنطلاق في الغالب إلى سر-198 كما هو موضح سابقا 52 ولكن أيضا أيد بعض أطياف الطيف الشامل حدثا الفسفرة واحد على الثريونين-195-199 أو الثريونين. عندما لوحظت الأحداث الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق، كان الجمع الغالبة من الأحماض الأمينية فسفرته سر-198-199 والثريونين على الرغم من أن مجموعات على مواقع أخرى لوحظت أيضا (الجدول 1). هذه النتائج تظهر بوضوح اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لوصف التفاصيل في جميع المواقع الفسفرة ممكن.
الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي: 1) استخراج كافية من البروتينات؛ 2) حماية PTMs، و 3) كمية كافية من البروتين الهدف. أولا، لاستخراج ما يكفي من البروتينات، فمن المهم لطحن الأنسجة في النيتروجين السائل وبعد ذلك إلى استخدام الخالط الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول. إذا الخالط الأنسجة غير متوفرة، ويمكن استخدام قذيفة هاون ومدقة. من المهم أيضا لاستخدام نسبة 1-3 (أو أربعة) من غرام من الأنسجة لحجم استخراج العازلة. وهذا النسيج لتخفيف نسبة وقوة عازلة العالية التي نقترح ضمان أن الرقم الهيدروجيني ستبقى محايدة أثناء عملية الاستخراج. وجدنا أن هذا له أهمية خاصة لA. thaliana والطماطم اضافيةctions 52. حماية PTMs يمكن تحقيقه عن طريق بما في ذلك في جميع مخازن مثبطات الانزيمات المناسبة التي يمكن إزالة PTMs. ومن الأهمية بمكان أيضا لأداء جميع الخطوات في 4 درجات مئوية وprechill مخازن والصكوك. ويمكن تحقيق عائدات أعلى من البروتين المستهدفة باستخدام النباتات معربا عن البروتين بكميات كافية وباستخدام كميات عالية من الأنسجة (حوالي 20 غراما). الخطوة الأكثر أهمية للحصول على كميات كافية من البروتين الهدف هو تركيز البروتين الهدف عن طريق مناعي مباشرة. وسلط الضوء على أهمية هذه الخطوة التي كان فشلنا في تحديد PTMs من قدرة الإنطلاق بعد مناعي الملف Prf نظرا لكمية محدودة من coimmunoprecipitated التسليح (الشكل 2B). في المقابل، مناعي مباشرة لجهاز السياحة أسفرت عن الببتيدات إلى حد كبير أكثر قابلية للقياس (الشكل 2C) مما أدى إلى تغطية حوالي 80٪ من بروتين تسلسل وتحديد PTMs (الجدول 1). نحن أيضا شارعيوصي rongly استخدام حاتمة به للبروتين مناعي. بالمقارنة مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الأم مصفوفة البروتينات حاتمة به تقارب يمكن أن تسفر عن كميات أكبر من البروتين النقي جزئيا. باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتين قدرة الانطلاق الأصلي 51 (الشكل 2A) للمناعي، وكنا قادرين على تحديد واحد فقط من الفسفرة الموقعين الفسفرة الغالبة من قدرة الإنطلاق.
وقد وضعت في المقام الأول هذا البروتوكول لتنقية جزئية من N. benthamiana حشوية البروتين وتحديد اللاحقة من المواقع الفسفرة بهم. ومع ذلك، باستخدام التعديلات الموصوفة هنا، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لA. البروتينات thaliana وغشاء ملزمة البروتينات. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لانتاج كميات كافية من البروتين المستهدف لتحديد PTMs وليس لتحقيق أعلى نقاء المجمع. إذا نقاء أعلىمطلوب من المجمع خطوة الثانية من تنقية يمكن أن تضاف إلى هذا البروتوكول 52. في هذه الحالة، فإن الخطوة الأولى تسمح شطف من البروتين الهدف من مصفوفة تقارب دون استخدام أملاح عالية أو حمض والخطوة اللاحقة قد يترتب عليها مصفوفة، الأمر الذي يتطلب ظروف قاسية شطف. من المهم التأكيد على أن اختبرناها فقط هذا البروتوكول لتحديد المواقع الفسفرة وأننا حاليا اختبار قدرتها لتحديد مفصل لPTMs إضافية.
نتائجنا تظهر بوضوح ممثل اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لتوصيف المواقع الفسفرة. الأهم من ذلك، أنها تسلط الضوء على أن تحديد مواقع الفسفرة تعتمد في كمية قليلة من البروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي والطفرات نقطة واحدة من المواقع لصناعة السيارات في الفسفرة يمكن أن تعطي نتائج مربكة. نعرض هنا وسابقا 47 </sup> يترافق أن الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق على سر-198-199 والثريونين مع تفعيل المجمع الملف Prf / جهاز السياحة. في المقابل، أظهرت النتائج التي نشرت في وقت سابق أن الطفرات 47،63 نقطة واحدة من السير-198-199 والثريونين إلى ألانين، التي تمنع الفسفرة على هذه المواقع، هي قادرة على إشارات تشير إلى أن الفسفرة من هذه المواقع ليست شرطا أساسيا لتفعيل معقدة . ويمكن الآن هذه النتائج يمكن تفسيرها من خلال الفسفرة من الموقع الثانوي الثريونين-195. نظرة مماثلة في اللدونة موقع الفسفرة الأخرى بروتين كيناز يمكن الحصول على هذا البروتوكول التالية. علاوة على ذلك، نهج الجمع باستخدام مواقع الفسفرة نقطة الطفرات، والبروتينات التي يمكن أن تمنع تحركات محددة (المستجيبات) إلى جانب مناعي البروتين وتحليل الطيف الكتلي سوف يؤدي إلى فهم أفضل لأهمية التطورية للاللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم VN من قبل الجمعية الملكية. JPR هو المستقبل زميل مجلس البحوث الأسترالي (FT0992129). نشكر الدكتور ميريام جيفورد لقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
Referências
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D’Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -. J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D’Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
