Vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é um vírus humano neurotrópico persistente, que estabelece uma infecção latente a longo prazo nos neurónios do gânglio trigeminal (TG) do sistema nervoso periférico, a partir do qual reactiva periodicamente para replicar e propagação. O HSV-1 é um genoma de 150 kb de dsDNA de localizações no núcleo do neurónio hospedeira, onde permanece como chromatinized plasmídeos multicópia, que não se integram no genoma da célula hospedeira ^{de 1,2.} Durante a latência, o programa genético de HSV-1 do ciclo replicativo é fortemente reprimida, e a expressão do gene é restringida ao transcrito associado à latência (TAL), locus de estabelecimento de latência para o início da reactivação ^3. LAT produz um longo 8,5 kb não codificante RNA transformado em um grande 2 kb lariat estável, e vários miRNA ^4-7. HSV-1 latência é assim caracterizado pela presença do ADN genómico virai, o ARN LAT, e a ausência de proteínas do ciclo replicativo detectáveis.

ONTEÚDO "> Os modelos animais, predominantemente rato e coelho, são modelos experimentais recapitulando várias características de latência em humanos. Um dos principais interesses desses modelos é que eles permitem estudar aspectos fisiológicos do HSV-1 latência em hospedeiros imunocompetentes. Nas últimas décadas , muitas ferramentas experimentais, tais como vírus e ratinhos geneticamente modificados, foram desenvolvidos para estudar a fisiologia, genética e biologia celular do HSV-1 de latência, a partir de tecidos animais. Até agora, ADN genómico virai foi detectado e quantificado por mancha de Southern e qPCR de TGs dissociada. No entanto, não existe presentemente nenhum método disponível para a detecção de HSV-1 do genoma por hibridização in situ em secções de tecido ^8. Consequentemente, a latência é rotineiramente avaliada em seções histológicas, através da detecção de LAT RNA por hibridação in situ de ARN em vez de A detecção do genoma viral. Porque não tem sido possível caracterizar as células infectadas com base na presença de genomas virais, this limitação técnica tem sido uma grande desvantagem para a análise de muitos aspectos das interacções hospedeiro-vírus, tais como a relação entre o genoma viral e a expressão de genes celulares e virais ou do hospedeiro mediadas por células de resposta imune ^9,10.

Mais importante ainda, a heterogeneidade da célula-a-célula da infecção latente permanece relativamente inexplorado e foi mostrado ser uma característica chave de latência em ratos e em neurónios sensoriais ganglionares humanos implantados em ratos SCID ^11-17. Tipicamente, foi mostrado por qPCR que o genoma de HSV-1 Número de cópia por célula varia de 5 a várias centenas. Embora LAT aparece como um regulador chave da latência e reativação, os dados de qPCR em neurônios isolados e in situ PCR indicaram que apenas um subconjunto de neurônios latentes infectadas, tão baixo quanto 30%, expressa o locus LAT ^11,12,18-21. Como a célula hospedeira e o ambiente celular no tecido impacto sobre o estabelecimento de latência do vírus ea expressão do gene viral permanece obscura. Descrevemos aqui um sólido fluorescente de hibridização in situ (FISH), o método para a detecção eficiente de baixa cópia de HSV-1 de ADN genómico dentro de secções de tecido de animais neuronais. Este método foi desenvolvido e utilizado por nós para obter acesso a resolução da microscopia de imagem de alta que é necessário estudar a interação do genoma viral com a célula hospedeira componentes intra-nucleares ^22. Além disso, é descrito um método de coloração de múltiplos para a detecção simultânea do DNA viral com RNA e proteínas, o que é uma ferramenta única para descrever as interacções vírus-hospedeiro que regulam a expressão de genes virais. O método também pode ser aplicado a uma ampla gama de análises que requerem a detecção de HSV-1 do genoma latente, tais como a quantificação neurónios infectados em grande número de secções. Um passo fundamental é aplicar o tratamento de recuperação antigênica para fazer o DNA viral acessível a hibridização. Assim, este protocolo também pode ser eficiente para a detecçãode outros vírus dsDNA, que não são atualmente detectável por abordagens DNA-FISH convencionais dentro tecidos animais.