Dissekera Innate Immun Signalering i Viral Evasion av cytokinproduktion
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att mäta den antivirala cytokinproduktion hos möss som infekterats med en modell herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) som är nära relaterad till människans Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV) och Epstein-Barr-virus (EBV). Med användning av genetiskt modifierade musstammar och möss embryonala fibroblaster (MEFs) bedömde vi det antivirala cytokinproduktion både in vivo och ex vivo. "Beredning" ett uttryck för medfödda immun komponenter i knockout embryonala fibroblaster genom lentiviral transduktion, vi ytterligare precisera vissa medfödda immunmolekyler och dissekera de viktigaste signalsystem händelser som på olika sätt reglerar den antivirala cytokinproduktion.
Abstract
Som svar på en virusinfektion, är värd medfödda immunsvaret aktiveras för att uppreglera genexpression och produktion av antivirala cytokiner. Omvänt har virus utvecklat intrikata strategier för att kringgå och utnyttja värd immun signalering för överlevnad och förökning. Viral immun skatteflykt, innebärvärdförsvar och viral skatteflykt, ger en av de mest fascinerande och dynamiska gränssnitt för att urskilja samspelet värd-virus. Dessa studier vår överenskommelse i medfödda immunreglering och bana väg för att utveckla nya antivirala terapier.
Murina γHV68 är en naturlig patogen av murina gnagare. γHV68 infektion av möss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka antiviral respons på mänsklig KSHV och EBV varav störning av in vivo virus-värd interaktioner är inte tillämplig. Här beskriver vi ett protokoll för att fastställa den antivirala cytokinproduktion. Detta protokoll kan anpassas till andra viranvänder och signalvägar.
Nyligen har vi upptäckt att γHV68 kapar MAVS och IKKβ, nyckel innate immune signalerings komponenter nedströms om den cytosoliska RIG-I och MDA5 att upphäva NFkB aktivering och antivirala cytokinproduktion. Specifikt aktiverar γHV68 infektion IKKβ och att aktiverade IKKβ fosforylerar RelA att accelerera RelA nedbrytning. Som sådan, γ HV68 kopplas effektivt NFkB aktivering från dess uppströms aktiverade IKKβ, motverkar antiviral cytokin genuttryck. Denna studie belyser en intrikat strategi där det uppströms medfödda immunaktivering fångas upp av en viral patogen för att upphäva den omedelbara nedströmstranskriptionsaktiveringen och undgå antivirala cytokinproduktion.
Introduction
Nya studier har beskrivit de totala signalkaskader i monterings värd medfödda immunsvar. Bosatta inom olika fack, mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs) upptäcka patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) av olika ursprung att utlösa medfödda immun signalering 1. Den retinoinsyra-inducerad gen I (RIG-I) och melanom differentieringsantigen 5 (MDA5) proteiner är cytosoliska sensorer som känner igen RNA arter med specifika strukturella egenskaper 2. Vid aktivering, RIG-I interagerar med sina nedströms MAVS (även kallad IPS-1, VISA, och Cardif) adapter som i sin tur aktiverar IKK (IKKαβγ) och IKK-relaterade kinas (TBK1 och IKKε, även känd som Ikki ) komplex 3-6. Aktiverade medfödda immun kinaser fosforylerar viktiga regulatorer av genuttryck, inklusive transkriptionsfaktorer och inhibitorer därav, och göra det möjligt för transkriptionsaktivering av värd antivirala gener (t.ex. IL6, TNF & #945,, CCL5, och IFN). Dessa signalering kaskader utgör potenta inneboende medfödda immunsvar som etablerar en antimikrobiell tillstånd att begränsa patogen utbredning under tidiga stadier av infektion.
Murina γHV68 är nära besläktat med human onkogena KSHV och EBV. Sålunda γHV68 infektion i möss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka värdimmunsvaret mot gamma herpesvirusinfektion in vivo 7. Använda γHV68, har vårt labb avslöjat ett intrikat strategi där γHV68 kapar värd medfödda immunsignalering för att möjliggöra virusinfektion. Å ena sidan γHV68 aktiverar MAVS-IKKβ pathway att främja virala transkriptionsaktivering via rikta aktiverad IKKβ att fosforylera replika transaktivator (RTA), den virala transkriptionsfaktor nyckel för γHV68 replika 8. Å andra sidan, initierar IKKβ-medierad fosforylering RelA för nedbrytning och siktinates NFkB aktivering 9. Som sådan γHV68 infektion undviker effektivt antivirala cytokinproduktion. Intressant, en screening använder ett uttryck bibliotek av γHV68 identifierade RTA som E3 ligas att framkalla RelA nedbrytning och upphäva NFkB aktivering 10. Dessa rön avslöja en invecklad immun skatteflykt strategi där uppströms immun signalering händelser utnyttjas av γHV68 att förneka den ultimata antiviral cytokinproduktion.
Här beskriver vi ett protokoll för att mäta den antivirala cytokinproduktion hos möss som infekterats med γHV68 både in vivo och ex viv o. I det protokoll som vi ytterligare utforska "rekonstituerad" uttryck för medfödda immun komponenter i knockout embryonala fibroblaster från Lentiviral transduktion, som preciserar funktionen av specifika medfödda immunmolekyler i regleringen av antivirala cytokinproduktion. Detta protokoll kan lätt anpassas till andra viruSES-och signalsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viral immun skatteflykt är en av de mest dynamiska och fascinerande samspel gränssnitt viral brott och värdförsvar 9. Värd medfödda immun komponenter är strukturerade så att signaltransduktion effektivt initieras och troget överförda. Avgränsar hierarkin och reglering av signalkaskader är en framstående ämne av medfödd immunitet. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera de regulatoriska rollerna för en medfödd immun komponent, MAVS, i viral kringgående av cytokinproduktion. Pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vildtyp (Mavs + / +) och knockout (Mavs – / -)-möss av vildtyp (Mavs + / +) och knockout (Mavs – / -) fick MEFs vänligen tillhandahållen av Dr Zhijian J. Chen (University of Texas Southwestern Medical Center) 13. Denna publikation är baserad på arbete som finansierats genom anslag från NIH (R01 CA134241 och R01 DE021445) och American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).
Materials
Referências
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).
- Kawai, T., et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Xu, L. G., et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
- Meylan, E., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Dong, X., et al. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. , (2010).
- Dong, X., Feng, P. Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Dong, X., et al. Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation. J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).
- Dong, X., Feng, P. Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus. J. Vis. Exp. , (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
- Sun, Q., et al. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
