Nevronale morphogenesis og migrasjon er avgjørende hendelser som ligger til grunn riktig hjernens utvikling. Her beskriver vi metoder for å manipulere genetisk dyrkede lillehjernen granule neuroner og utviklingslillehjernen for vurdering av morfologi og trekkende karakteristikker av nerveceller.
Utviklings hendelser i hjernen inkludert nevronale morphogenesis og migrasjon er sterkt orkestrert prosesser. In vitro og in vivo-analyser gir mulighet for en grundig karakterisering å identifisere stier involvert i disse hendelsene. Lillehjernen granule neuroner (CGNs) som er utledet fra utviklingslillehjernen er en ideell modell system som gjør det mulig for morfologiske analyser. Her beskriver vi en metode for hvordan man skal manipulere genetisk CGNs og hvordan å studere axono-og dendritogenesis av enkelte nerveceller. Med denne metoden effekten av RNA-interferens, overekspresjon eller små molekyler kan bli sammenlignet med kontroll neuroner. I tillegg er den gnager cerebellar cortex en lett tilgjengelig in vivo-system på grunn av sin dominerende postnatal utvikling. Vi presenterer også en in vivo electroporation teknikk for å manipulere genetisk utviklings cerebella og beskrive påfølgende lillehjernen analyser for å vurdere neuronal morfologi ennd migrasjon.
Den cerebellum er et utmerket system for å studere mekanismene for axon vekst og migrering. Lillehjernen har vært gjenstand for anatomiske studier siden tidenes morgen nevro en. Moderne mikroskopi og immunhistokjemiske teknikker har betydelig utvidet og videreutviklet de første funnene av Santiago, Ramon, og Cajal 2-4. Muse genetikk og molekylær studier avdekket vesentlige vekst og transkripsjonsfaktorer i kontroll av lillehjernen utvikling, noe som førte til større forståelse for viktige hendelser som kreves for riktig kabling av forskjellige typer nevroner inkludert lillehjernen granule neuroner (CGNs) 5-7.
Lillehjernen er et derivat av rhombomere en av utviklings hindbrain åtte. Den rombiske leppe, som er en del av taket av 4 th hjertekammer, gir opphav til cerebellare granule neuron stamceller, som vil utgjøre den mest tallrike neuronal populasjon ivoksen cerebellum ni. Etter rostral migrasjon, de ender opp i lillehjernen anlage. Her, mitose av granule neuron forløpere fører til dramatisk utvidelse av den eksterne granulær laget (EGL), som finner sted etter fødselen hos gnagere. Fra EGL, nerveceller begynner å migrere innover gjennom den molekylære lag (ML), forbi Purkinje cellelaget til slutt å ta seg ned i det indre granulære sjikt (IGL 2). I løpet av denne trekkprosessen, skaffe de en bipolar form med to axoner som strekker seg inn i den ML. Ved videre migrering, migrerer cellelegemet bort fra axoner og de to prosesser som smelter for å danne en gaffelformet, T-formet axon 10.. Deretter ble disse axoner fasciculate og blir referert til som parallelle fibre. Etter å ha avgjort i IGL, CGNs vokse dendritter, som danner dendrittiske klør for å etablere synapser med mosegrodde fibre. For å undersøke de grunnleggende prosesser i utviklingen av lillehjernen, et kombinert in vitro og in vivo approach åpner for pålitelige resultater og konklusjoner.
CGNs ikke bare er de mest tallrike nevroner i cerebellum, men i hele hjernen og kan bli dyrket til høy renhet 11-13. I kultur, blir dette svært homogen nevronale befolkningen raskt postmitotic og får en polar morfologi med lett identifiserbare axoner og dendritter. Dyrkede CGNs har vist seg å være svært nyttig å studere ulike aspekter av nevronale utvikling inkludert stamfar spredning, differensiering, aksonal og Dendritt utvikling, neuronal migrasjon, apoptose og elektrofysiologiske egenskaper (14-19 og mange andre). Bruk av genetisk manipulasjon har utvidet allsidighet av dyrkede CGNs og lov for videre mekanistisk innsikt i de nevnte hendelsene. Transfeksjon av dyrkede nevroner bruker laveffektivt kalsiumfosfat eller lipofile metoder etterfulgt av immunocytochemistry med polaritet markører eller programvare-støttet analyse facilitates vurderingen av f.eks morfologien av individuelle nevroner i en tett neuronal kultur. Med denne tilnærmingen, kan rollen som proteiner av interesse i akson eller Dendritt vekst studeres 20-25,26-28. Denne kulturen systemet er imidlertid mindre nyttig å analysere neuronal migrasjon som migrasjon er svært begrenset i høy tetthet kulturer og ville kreve cocultures. Den in vitro-analyse av akson-og dendritt vekst gjør det også mulig for undersøkelse av sammenknyttede proteiner av en signalveien ved hjelp av kombinasjoner av RNA interferens (i), over-ekspresjon eller små molekyler.
Å etablere relevansen av proteinet av interesse i akson og Dendritt vekstregulering eller neuronal migrasjon, in vivo electroporation (IVE) teknikken gjør det mulig for analysen i utviklingslillehjernen cortex. På grunn av det faktum at cerebellar utvikling hos gnagere strekker seg helt inn i de to første uker etter fødselen, representerer cerebellum en accessible hjernestruktur for genetiske manipulasjoner for å undersøke utviklingen av aksoner og dendritter, neuronal migrasjon, synaptogenesis og apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. I tillegg er også nyttig for andre aspekter av neuronal utvikling som krever intakt lillehjernen cortex som axon pathfinding, kabling og tilkobling av nerveceller og nervecellen-gliaceller interaksjoner tatt sammen denne modellen system, gir denne protokollen in vitro og in vivo teknikker for å takle en komplementær tilnærming om nevronale morphogenesis og migrasjon.
Fordeler og ulemper ved den beskrevne in vitro-og in vivo-metoder:
Dyrkede CGNs fra mus og rotter er like godt egnet for morfologiske analyser. På grunn av større størrelse med en rotte lillehjernen, utbyttet av CNG og står fra rotteunger overgår museunger 3-4x. Bortsett fra CGNs kan kortikale og hippocampus-neuroner bli brukt som kultursystem i tillegg. Den kalsiumfosfatmetoden resulterer i en lav (0,01 til 5%) transfeksjon effektivitet, noe som er ønsket å analysere morfolo…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker N. Schwedhelm-Domeyer for utmerket teknisk assistanse, C. Hammer og S. Papiol for hjelp med statistiske analyser. Vårt arbeid er finansiert av Max Planck Society, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Senter for nanoskala Mikros, og molekylær fysiologi av hjernen (CNMPB), Göttingen, Tyskland og ved GGNB Junior Gruppe stipend på Universitetet i Göttingen.
DMEM | Gibco | 11960-044 | |
BME | Gibco | 41010-026 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
SP2 confocal microscope | Leica | ||
ImageJ | NIH | ||
Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
MS Excel | Microsoft | ||
Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |